J Gastroenterol. 2024 Feb;59(2):95-108.
<Introduction>
자가면역 위염(AIG)에 대한 개요 및 유전자 발현 분석 연구
자가면역 위염(Autoimmune gastritis, AIG)은 위에서 벽세포(proton pump H⁺/K⁺-ATPase)에 대한 자가면역 반응이 특징적인 만성 염증성 질환이다 [1–3]. AIG의 유병률은 일반 인구에서 0.5~19.5% 보고된 바 있으며 [3], 질병이 진행됨에 따라 내인성 인자(intrinsic factor) 감소로 인한 악성 빈혈(pernicious anemia) 및 신경내분비 종양(neuroendocrine tumor, NET), 선암(adenocarcinoma)과 같은 악성 병변이 발생할 수 있다 [2,3].
병리학적으로 AIG는 벽세포의 파괴로 인한 위체부 점막의 심한 위축과 신경내분비 세포 과증식을 특징으로 하며, 이러한 세포는 크로모그라닌(chromogranin) 및 시냅토피신(synaptophysin)을 발현한다 [4,5]. 만성적인 위 점막 염증이 장기간 지속되면, AIG는 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 감염성 위염(HPG)과 유사한 장형 화생(intestinal metaplasia)을 유발할 수 있다 [2,3].
그러나 AIG와 HPG의 만성 염증에 대한 분자적 기전은 상당히 다르다. AIG는 자가면역 반응에 의해 유발되는 반면, HPG는 그람음성균인 헬리코박터 파일로리의 만성 감염과 그 독성 인자(예: Cag A, Vac A)에 의해 발생한다 [1–3]. 또한, AIG의 염증 반응을 매개하는 주요 면역세포는 자가반응성 T세포(autoreactive T cells)이며, HPG의 경우 대식세포(macrophages)와 호중구(neutrophils)와 같은 탐식세포(phagocytes)가 주된 역할을 한다 [2,3].
AIG에 대한 다수의 조직학적 연구가 이루어졌지만, 분자 수준에서의 연구는 제한적이며 [6,7], AIG 점막을 이용한 포괄적인 유전자 발현 분석 연구는 아직 보고된 바가 없다. 우리 연구팀은 이전 연구에서 AIG 점막이 HPG 및 정상 점막과는 독특한 DNA 메틸화 프로파일을 가진다는 사실을 보고한 바 있으며 [6], 이는 특정한 유전자 발현 양상이 존재할 가능성을 시사한다.
AIG의 특이적 유전자 발현 프로파일과 신호 전달 경로를 분석함으로써, AIG의 조직학적 변화, 면역 반응, 종양 발생과 같은 질병 표현형을 유추할 수 있다.
본 연구에서는 AIG 위 점막이 특정한 유전자 발현 패턴을 가지는지를 확인하고자 하였다. 이를 위해, AIG, HPG, 정상 위 점막을 대상으로 포괄적인 유전자 발현 분석을 수행하였으며, AIG에 의해 발생하는 유전자 발현 변화의 잠재적 기전도 탐색하였다.
<Methods>
Study design and tissue sample collection
본 연구는 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 감염이 없는 AIG 환자, HPG 환자, 그리고 내시경 생검을 시행한 건강한 자원자를 대상으로 한 다기관 연구(multicenter study)이다. 연구는 각 참여 기관의 윤리위원회(Institutional Review Board, IRB)의 승인을 받았으며, 2020년 3월 1일 일본 대학병원 의료 네트워크(UMIN)에 등록되었다 (UMIN000039528). 모든 생검 샘플은 환자로부터 서면 동의(written informed consent)를 받은 후 채취되었다.
환자 선정 및 생검 과정
연구에 등록되기 전에 내시경 평가(endoscopic evaluation)가 수행되었으며, AIG 및 HPG 환자의 샘플은 Kimura–Takemoto 분류법에서 O-II 또는 O-III로 정의되는 심한 개방형 위축(severe open-type atrophy)을 가진 환자만 포함하였다 [8] (Fig. 1).
Fig. 1 Typical endoscopic views of the gastric body and antrum in cases of autoimmune gastritis (AIG), H. pylori-associated gastritis (HPG), and non-infammatory normal mucosa (normal)
AIG와 HPG의 진단은 다음과 같은 방법으로 확인되었다.
- AIG 진단: 항벽세포 항체(anti-parietal cell antibody, PCA) 혈액 검사
- HPG 진단:
- 혈청 항-H. pylori 항체 검사
- 급속 요소분해효소 검사(rapid urease test)
- 조직학적 H. pylori 감염 여부 확인
참여자 중 위산 억제제(gastric acid suppressants) 사용 환자, 위절제술(gastrectomy) 병력이 있는 환자, 또는 H. pylori 제균 치료를 받은 환자는 포함되지 않았다. 모든 생검 샘플은 환자로부터 서면 동의를 받은 후 채취되었다.
샘플 채취 및 보관
모든 위 점막 샘플은 위체부(gastric body) 중부의 대만(greater curvature)에서 내시경 생검을 통해 채취되었으며, 이후 RNAlater (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)에 보관한 후 -80°C에서 저장되었다.
유전자 발현 분석을 위한 샘플 사용
포괄적인 유전자 발현 분석(comprehensive gene expression analysis):
- AIG 샘플 14개
- HPG 샘플 13개
- 정상 샘플 9개 (Table 1)
조직학적 분석(histological analysis):
정량적 실시간 RT-PCR(quantitative real-time RT-PCR) 분석:
- AIG 샘플 14개
- HPG 샘플 7개
- 정상 샘플 3개 (Table S1)
Table 1 Characteristics of cases used for comprehensive gene expression analyses
Comprehensive analysis of gene expression
유전자 발현 분석 방법
총 RNA는 RNeasy Mini Kit (Qiagen, CA, USA)를 사용하여 추출되었다. RNA의 순도(purity) 및 RNA 무결성 지수(RNA Integrity Number, RIN) 값은 NanoDrop1000 분광광도계(Thermo Fisher Scientific)와 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, CA, USA)를 이용하여 평가되었다.
포괄적인 유전자 발현 분석(comprehensive gene expression analysis)은 Agilent SurePrint G3 Human Gene Expression 8 × 60K v3 Microarray Kit (Agilent Technologies)를 사용하여 수행되었으며, 얻어진 데이터는 Gene Expression Omnibus (GSE233973) 데이터베이스에 저장되었다.
조직에서의 유전자 발현 데이터는 Genotype-Tissue Expression Project (GTEx) 데이터베이스 (https://www.gtexportal.org/)에서 획득되었다. 각 조직별 유전자 발현 수준의 평균(mean) 및 표준편차(Standard Deviation, SD)를 계산하였으며, 평균 + 2SD를 초과하는 상위 25개의 유전자를 조직 특이적 유전자(tissue-specific genes)로 정의하였다.
Gene expression informatics
1. 정량화(normalization) 및 전처리
- Quantile normalization(분위수 정규화)은 R(version 4.0.5)에서 Bioconductor의 limma 패키지(version 3.46.0)를 사용하여 수행되었다.
- 마이크로어레이에서 분석된 58,201개의 프로브(probes) 중, 유전자 심볼(gene symbols)이 있는 48,858개의 프로브만 추가 분석에 사용되었다.
- 신호 강도(signal intensity) 값은 이진 로그(binary logarithm) 값으로 변환되었다.
2. 계층적 군집 분석(hierarchical clustering analysis)
- 비 지도 학습 기반의 계층적 군집 분석(unsupervised hierarchical clustering analysis)은 Bioconductor의 Heatplus 패키지(version 2.36.0)를 이용하여 R에서 수행되었다.
3. 화산 그림(volcano plot) 시각화
- 유의하게 발현이 변화된 유전자를 시각화하기 위해 R의 ggplot2 패키지(version 3.3.6, CRAN)를 사용하여 화산 그림(volcano plot)을 작성하였다.
4. 유전자 기능 분석(gene ontology analysis)
- 유전자 기능 분석(Gene Ontology analysis)은 범주형 유전자 세트 강화 분석(categorical gene set enrichment analysis, GSEA version 4.1.0)을 사용하여 수행되었으며, 이를 통해 다르게 발현된 유전자(differentially expressed genes, DEGs)의 기능적 차이를 분류하고 강조하였다.
- KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 경로 데이터베이스에서 제공하는 표준 경로 유전자 세트(canonical pathway gene sets)가 사용되었다 [9].
5. 조직 특이적 유전자 분석(tissue enrichment analysis)
- 조직 특이적 유전자 분석은 TissueEnrich(https://tissueenrich.gdcb.iastate.edu/)을 이용하여 수행되었다 [10].
6. 단백질 상호작용 네트워크 분석(protein–protein interaction, PPI network analysis)
- 단백질-단백질 상호작용 네트워크(PPI network)는 STRING 데이터베이스(https://string-db.org/)를 사용하여 작성되었다 [11].
- 최소 요구 상호작용 점수(minimum required interaction score)는 높은 신뢰도(high confidence, 0.7)로 설정되었다.
Quantitative real‑time RT‑PCR
- 역전사(reverse transcription)는 Superscript IV Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 수행되었다.
정량적 실시간 PCR(Quantitative RT-PCR, qRT-PCR)은 CFX Connect Real-Time Detection System (Bio-Rad, CA, USA)을 사용하여 진행되었으며,
- SYBR Green I (Lonza, Basel, Switzerland)
- AmpliTaq Gold Polymerase (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 증폭이 이루어졌다.
유전자 전사체(gene transcript)의 복제 수(copy number)는 표준 DNA 샘플(standard DNA samples)의 증폭 결과와 비교하여 산출되었으며, GAPDH의 발현량을 기준으로 정규화(normalization)되었다.
대상 유전자(target genes) 및 GAPDH의 프라이머 서열(primer sequences)은 Table S2에 제시되었다.
Histological analysis
위 점막 생검 및 Sydney System 점수 분석
- 위체부(gastric body) 중부에서 위 점막 생검 샘플을 채취하였다.
- Updated Sydney System (USS) 점수를 이용하여 위축성 위염(mucosal atrophy) 및 장상피화생(intestinal metaplasia)의 차이를 AIG와 HPG 샘플 간에 분석하였다 [12].
- USS 점수는 0~3점 척도로 평가되었다.
- 0: 없음 (none)
- 1: 경미함 (mild)
- 2: 중등도 (moderate)
- 3: 심함 (severe)
Immunohistochemistry
- 위 점막 샘플은 신선하게 채취하여 포르말린 고정(formalin fixation) 후 파라핀에 포함(embedding in paraffin)하였다.
- 절편 두께(thickness): 2μm
- 이후 표준 절차(standard procedures)에 따라
- 탈파라핀화(deparaffinization)
- 재수화(rehydration)
- 내인성 과산화효소 비활성화(endogenous peroxidase inactivation)를 수행하였다.
항체를 이용한 면역조직화학 염색
- PNLIP (sc-374612; Santa Cruz Biotechnology, TX, USA)
- BCL10 (sc-5273; Santa Cruz Biotechnology)
- NKX2-1/TTF1 (SP141; Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)
- SFTPB (sc-133143; Santa Cruz Biotechnology)
- SFTPC (ab90716; Abcam, Cambridge, UK)
평가 과정
- 염색된 절편은 두 명의 병리학자(pathologists)가 독립적으로 평가하였다.
Cell culture
세포주 및 배양 조건
- AGS 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구매하였다.
- MKN74, MKN1, GCIY 세포주는 RIKEN BioResource Center (Ibaraki, Japan)에서 구매하였다.
산성 배양액(pH 6.5) 준비
- Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) with high glucose (Sigma-Aldrich, MO, USA)에 10 mM PIPES를 첨가하여 조제하였다.
대조군 배양액(pH 8.0) 준비
- DMEM with high glucose에 NaHCO₃ (FUJIFILM Wako, Osaka, Japan)를 첨가하고, 추가로 10 mM HEPES를 보충하여 조제하였다.
공통 배양 조건
- 모든 배양액에는 10% fetal bovine serum (FBS) 및 1% penicillin/streptomycin (Thermo Fisher Scientific)을 첨가하였다.
- 각각의 배양액은 37°C에서 목표 pH로 조정되었다.
- 실험 중 배양액의 pH가 일정하게 유지되는지 확인하기 위해 배양 전후 pH를 모니터링하였다.
<Results>
임상적 특성
- 임상적 특성은 Table 1 및 Table S1에 제시되어 있다.
- 모든 AIG 사례에서
- 위체부(gastric body)에서 위저부(fundus)까지 심한 점막 위축(severe mucosal atrophy)이 주로 관찰되었으며,
- 항-벽세포 항체(anti-PCA) 역가가 높게 나타남(>10 RU/mL) [13].
- AIG, HPG, 정상군 간에 종합적인 유전자 발현 분석 대상자들 사이에서 연령(age) 및 성별(sex)에 대한 유의한 차이(significant differences)는 관찰되지 않았다(Table S3).
AIG displayed a unique gene expression profle from HPG in gastric mucosa
종합적인 유전자 발현 분석 결과
경로 분석(Pathway Enrichment Analysis) 결과
AIG 및 HPG 샘플에서
- P-value 0.01 기준으로 유전자 세트 풍부도 분석(GSEA, Gene Set Enrichment Analysis)을 수행한 결과, 14개의 경로가 공통적으로 확인됨(Fig. 2c).
AIG 샘플에서 특징적으로 증가한 경로
- "포르피린 및 클로로필 대사(porphyrin and chlorophyll metabolism)"
- "전분 및 자당 대사(starch and sucrose metabolism)"
- -> 이는 위 점막에서 비정상적인 장 세포 분화(abnormal intestinal differentiation)가 진행되고 있음을 시사함.
HPG 샘플에서 특징적으로 증가한 경로
- "Fc-감마 수용체 매개 식균작용(Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis)" 등 다수의 염증 반응 관련 유전자 세트가 풍부하게 발현됨.
- -> 이는 HPG 위 점막에서 대식세포(macrophage) 및 호중구(neutrophil)와 관련된 강한 염증 반응이 존재함을 의미함.
Fig. 2 Results of the comprehensive analysis of gene expression among the AIG (n=14), HPG (n=13), and normal samples (n=9). a Volcano plot analysis using the fold changes of gene expression levels between the normal and AIG samples, and the normal and HPG samples. The number of gene transcripts with twofold change and a small P-value (-log10 (P-values)>1.301) was higher in the AIG samples than in the HPG samples. b Unsupervised hierarchical cluster analysis using gene expression levels of the total 36 samples. Using the 2500 gene transcripts with the highest standard deviation (TOP SD), the AIG and HPG samples were clearly separated from the normal samples and were further separated into the AIG-enriched cluster and the HPG-enriched cluster. c Pathway enrichment analyses conducted via GSEA using the upregulated genes in the AIG and HPG samples. The top eight activated gene sets in the AIG and HPG samples are shown. NES—normalized enrichment score
Upregulation of small intestine‑specifc genes and downregulation of stomach‑specifc genes induced in gastric mucosa with AIG
위 점막에서의 비정상적인 장 분화(Abnormal Intestinal Differentiation) 분석 결과
- HPG에서는 비정상적인 장 분화가 발생하는 것으로 알려져 있음 [15].
- AIG에서도 HPG만큼 뚜렷하게 장 분화가 유도되는지 확인하기 위해 TissueEnrich 분석을 수행함.
- AIG 샘플에서 십이지장 및 소장에서 특이적으로 발현되는 유전자들의 풍부도(enrichment)가 HPG보다 더 높게 나타남
- AIG: −log10 (P-value) = 68.5 (십이지장), 65.2 (소장)
- HPG: −log10 (P-value) = 25.8 (십이지장), 22.2 (소장) (Fig. 3a).
조직 특이적 유전자 발현 분석 결과
- GTEx 데이터베이스를 이용하여 조직 특이적 유전자(tissue-specific genes) 발현 수준을 비교
- 소장 특이적 유전자 및 위 특이적 유전자의 발현 분석 결과, AIG 샘플 대부분이 정상 샘플과 명확히 구별됨(Table S8, S9).
- 반면, 일부 HPG 샘플은 정상 샘플과 유사한 군집(cluster)을 형성함(Fig. 3b).
- 이는 AIG에서 HPG보다 더 빈번하게 장 분화가 발생함을 시사함.
Updated Sydney System(USS) 점수 기반의 조직학적 분석 결과
- AIG 샘플에서 장형화생(intestinal metaplasia)의 발생률이 높음
- AIG: 10/11명 (90.9%)
- HPG: 3/7명 (42.9%) (Fig. S2a).
- AIG 관련 장형화생은 HPG 관련 장형화생과 유사하게 MUC2 발현을 보였으나, MUC5AC 발현이 결핍됨 (Fig. 3c, S2b).
Caudal-type homeobox (CDX) 2 및 CDX1 발현 분석 결과
- CDX2 및 CDX1은 장 분화(intestinal differentiation)의 주요 조절 유전자(master regulator genes)이며, 상호 보완적인 역할을 하는 것으로 알려짐 [17,18,19].
- 모든 AIG 샘플 및 절반의 HPG 샘플에서 CDX2/1 발현이 높게 나타남(Fig. 3d).
- CDX2/1이 AIG에서 전사(transcription) 변화를 유도하는 역할을 하는지 확인하기 위해, CDX 시그니처 유전자(CDX signature genes) 발현 분석수행
- CDX 시그니처 유전자는 CDX가 안정적으로 발현되는 위암 세포에서 변화된 유전자로 정의됨 [20].
- AIG 및 HPG 샘플은 정상 샘플과 명확히 분리되었으며, 각각 AIG-특이적(AIG-enriched) 및 HPG-특이적(HPG-enriched) 클러스터로 further 분리됨(Fig. 3d).
- 모든 AIG 샘플에서 CDX2/1이 발현됨
- CDX-음성(signal intensity < 25)인 HPG 샘플들은 독립적인 군집(cluster)을 형성함.
- 이러한 결과는 위 점막에서의 장 전환(intestinal transdifferentiation)이 CDX-의존적(CDX-dependent) 방식으로 발생할 가능성을 시사함.
Fig. 3 Marked intestinal diferentiation in gastric mucosa with AIG. a Tissue enrichment analysis using top 50 upregulated genes in gastric mucosa with AIG and HPG. AIG showed higher enrichment of genes specifc to the duodenum and the small intestine compared with HPG. b Unsupervised hierarchical cluster analysis using gene expression levels of small intestine-specifc and stomach-specifc genes among the AIG (n=14), HPG (n=13), and normal samples (n=9). The AIG samples were clearly separated from the normal samples using small intestine and stomach-specifc genes, while a fraction of the HPG samples were grouped with the normal samples. c Immunostaining of MUC2 and MUC5AC using gastric mucosa with AIG. Scale bar: 100 μm. d Unsupervised hierarchical cluster analysis using gene expression levels of CDX signature genes, along with CDX2/1 expression (cutoff signal intensity=25). The AIG and HPG samples were clearly separated from the normal samples and were further separated into the AIG-enriched cluster and the HPG-enriched cluster. Moreover, all the AIG samples expressed CDX2/1, while the CDX negative HPG samples showed a unique cluster.
Gastric mucosa with AIG showed trans‑diferentiation into pancreas and lung
다음으로, AIG가 있는 점막에서 특이적으로 발현이 증가한 상위 25개의 유전자를 확인하였으며(Fig. 4a, 왼쪽), 이들은 정상 및 HPG 샘플에서 낮은 발현 수준(평균 신호 강도 <25)을 보였고, 정상과 HPG 샘플 간의 발현 변화도 최소한(<2배 변화)으로 나타났습니다(Table S10).
특히, AIG 특이적 유전자에는 췌장 소화 관련 유전자인 췌장 트라이아실글리세롤 리파아제(pancreatic triacylglycerol lipase, PNLIP) [21], 카복실 에스터 리파아제(carboxyl ester lipase, CEL) [22], 키모트립신 B1/C (chymotrypsin B1/C, CTRB1 및 CTRC) [23]가 포함되었습니다.
또한, 폐의 주요 조절 유전자인 NK2 호메오박스 1/갑상샘 전사인자 1 (NK2 homeobox 1/thyroid transcription factor 1, NKX2-1/TTF1) [24]과 폐포액 분비 관련 유전자인 서팩턴트 단백질 B 및 C (surfactant proteins B and C, SFTPB 및 SFTPC) [25]도 포함되었습니다.
더 나아가, AIG 특이적 유전자를 이용한 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크 분석에서 소화 및 폐포 라멜라체 관련 유전자 세트가 풍부하게 포함된 것으로 나타났습니다(Fig. 4a, 오른쪽). 일부 AIG 샘플에서는 이러한 유전자들이 실제로 발현되었으며(Figs. S3 및 S4), 췌장 및 폐 특이적 유전자(Tables S11 및 S12)를 사용하여 다른 샘플과 명확하게 구분되었습니다(Fig. 4b). 또한, 추가 샘플 세트를 대상으로 한 RT-PCR 분석을 통해 이러한 이소성 유전자 발현을 확인하였습니다(Figs. S5 및 S6, Table S1).
단백질 발현 수준과 분포를 확인하기 위해, AIG 샘플에서 새롭게 확인된 유전자 산물을 대상으로 면역조직화학 분석을 수행하였습니다(Figs. 4c 및 S7).
PNLIP와 BCL10, 즉 췌장 선방세포(pancreatic acinar cell) 마커 [26]는 AIG를 가진 위점막의 특정 영역에서 공동 발현되었으며, 이는 췌장 화생(pancreatic metaplasia) [27]이 발생하여 췌장 특이적 유전자 발현을 유도했음을 시사합니다.
반면, NKX2-1/TTF1의 확산된 발현이 AIG 위점막에서 관찰되었으며, 이와 함께 서팩턴트 단백질(SFTPB 및 SFTPC)의 발현도 확인되었습니다. 이는 AIG가 있는 위에서 보편적으로 폐 관련 전환(pulmonary trans-differentiation)이 일어남을 의미합니다.
종합적으로 볼 때, AIG가 있는 위점막은 HPG가 있는 점막보다 훨씬 다양한 형태의 세포 전환(trans-differentiation)을 겪는 것으로 보입니다.
또한, HPG 점막에서 특이적으로 발현이 증가한 유전자(Table S13)에는 사이토카인 IL6, CXCL8, CXCR2가 포함되었으며, 이는 다수의 염증 반응 관련 유전자 세트와 연관이 있었습니다(Fig. S8).
특히, CXCL8은 주로 대식세포(macrophages)에 의해 분비되며, 호중구(neutrophil) 이동을 유도하는 것으로 알려져 있습니다. 이는 조직학적 소견 [28] 및 앞서 설명한 경로 강화 분석(Fig. 2c)의 결과와도 일치합니다.
Fig. 4 Trans-diferentiation into the pancreas and lung in gastric mucosa with AIG. a Protein–protein interaction (PPI) network analysis using AIG-specifc genes. The observed networks (Network A and Network B) showed the enrichment of gene sets related to digestion and the alveolar lamellar body. FDR—false discovery rate. b Unsupervised hierarchical cluster analysis using gene expression levels of pancreas-specifc and lung-specifc genes among the AIG (n=14), HPG (n=13), and normal samples (n=9). A fraction of the AIG samples was clearly separated from the other samples. c Immunostaining of AIG-specifc genes related to abnormal diferentiation of the pancreas (PNLIP and BCL10) and lung (NKX2-1/TTF1, SFTPB, and SFTPC) using gastric mucosa with AIG. Scale bar: 100 μm
Environmental acidic condition possibly afects expression levels of intestine‑related genes
AIG가 유전자 발현에 미치는 영향을 탐색하기 위해 먼저 DNA 메틸화(DNA methylation)에 초점을 맞추었습니다. 이는 AIG가 있는 위점막에서 프로모터 CpG 섬(CpG islands, CGI)에서 비정상적인 DNA 메틸화가 발생함이 보고되었기 때문입니다 [6].
특히, 발현이 증가하거나 감소한 대부분의 유전자에는 프로모터 CGI가 존재하지 않았으며(Tables S4 및 S5), 이는 해당 유전자들이 TATA 박스(TATA box) 요소에 의해 조절됨을 시사합니다. 일반적으로 CGI에 의해 조절되는 유전자들은 기본적인 세포 기능에 필수적인 housekeeping 유전자 및 종양 억제 유전자를 포함합니다 [29–31]. 반면, TATA에 의해 조절되는 유전자들은 특정 환경적 조건과 자극에 따라 발현 수준이 조절되는 유도성 유전자(inducible genes)인 경우가 많습니다 [32].
따라서, 우리는 AIG가 있는 위점막에서 두드러지게 나타나는 환경적 변화에 주목하였습니다.
AIG에 의해 벽세포(parietal cells)가 파괴된 결과, ATP4A 및 ATP4B의 발현 수준이 AIG 샘플에서 HPG 샘플보다 현저하게 감소하였으며(Fig. S9 및 Tables S14 및 S15), AIG 위점막에서는 pH가 현저히 높은 것으로 보고되었습니다 [33, 34].
이에 따라, 우리는 환경적 pH 증가가 AIG 위점막에서 비정상적인 세포 전환(trans-differentiation)을 유도할 수 있다는 가설을 세웠습니다.
이 가설을 검증하기 위해, 위암 세포주(AGS, MKN74, MKN1, GCIY)를 산성 환경과 대조군 조건에서 배양한 후 유전자 발현 변화를 분석하였습니다.
그 결과, 산성 조건에서는 소장의 주요 조절 유전자(master regulator)인 CDX2 [17] 및 줄기세포 마커 유전자 LGR5 [35], ASCL2 [36], OLFM4 [37]의 발현이 감소하는 것으로 나타났습니다(Fig. 5a). 또한, 세포주 간 평균적인 소장 특이적 유전자 발현 변화 역시 산성 조건에서 감소하는 경향을 보였습니다(Fig. S10). 반면, AIG에서 확인된 췌장 및 폐 관련 유전자들의 발현에는 거의 변화가 없었습니다.
Fig. 5 Abnormal intestinal diferentiation by environmental acidic conditions. a Gene expression changes in gastric cancer cell lines (AGS, MKN74, MKN1, and GCIY). Acidic conditions downregulated the expression levels of a master regulator gene of the small intestine, CDX2, and stem marker genes, LGR5, ASCL2, and OLFM4. b Unsupervised hierarchical cluster analysis using gene expression levels of pancreas-specifc and lung-specifc genes among the AIG (n=14), HPG (n=13), and normal samples (n=9). The AIG and HPG samples were clearly separated from the normal samples and were further separated into the AIG-enriched cluster and the HPG enriched cluster.
<Discussion>
우리의 연구가 AIG로 인한 유전자 발현 변화를 종합적으로 분석한 최초의 보고라는 점에서 의의가 있습니다. AIG가 있는 위점막은 HPG 또는 비염증성 정상 점막과 비교했을 때 독특한 유전자 발현 프로파일을 나타냅니다.
특히, AIG에서는 잘 알려진 장형화생(intestinal metaplasia)뿐만 아니라 비정상적인 췌장 및 폐 분화가 관찰되었습니다. 또한, AIG로 인해 환경적 pH가 증가하면 위점막에서 비정상적인 분화를 유도할 가능성이 있습니다.
AIG와 HPG 모두 위에서 장의 이소성 분화를 유발하는 만성 염증을 동반하지만, 본 연구 결과는 AIG가 있는 위점막에서 HPG보다 장 특이적 유전자 발현이 더 두드러짐을 보여줍니다. 그러나, HPG는 위 전정부에서 시작되어 체부로 확산되며, 주로 전정부에서 장형화생을 유발합니다.
AIG와 HPG 간 유전자 발현 차이에 대한 염증 부위의 영향을 줄이기 위해, 본 연구에서는 AIG와 HPG 모두에서 심한 개방형 위축(severe open-type atrophy) 상태의 점막을 분석 대상으로 선정하였으며, 위 체부 중간부에서 채취한 생검 샘플을 사용하였습니다.
그 결과, 유전자 발현 수준에서 관찰된 AIG와 HPG 간 차이를 반영하듯, AIG 샘플에서 HPG 샘플보다 장형화생의 발생률이 더 높은 것으로 나타났습니다.
장형화생은 위암 발생의 위험 요인으로 간주됩니다. 그러나, H. pylori 감염이 없는 AIG 환자의 경우, HPG 환자보다 위암 발생률이 낮다는 보고와는 대조적인 결과를 보였습니다 [3]. 또한, AIG에서 발생한 위암은 주로 위형 점액(gastric-type mucin)을 발현하는 경향이 있었습니다 [38].
이러한 차이를 설명하는 가설 중 하나는, AIG 점막에서는 HPG 점막보다 발암과 관련된 비정상적인 DNA 메틸화를 유도하는 염증 반응의 정도가 낮기 때문일 가능성입니다 [39–43]. 차등 발현 유전자(differentially expressed genes)를 활용한 경로(enrichment) 분석 결과, HPG가 있는 위점막에서 대식세포-호중구 축(macrophage–neutrophil axis)의 염증 반응과 관련된 유전자 세트가 더 풍부하게 발현되었으며, HPG가 있는 위점막에서 AIG보다 비정상적인 DNA 메틸화가 더 많이 보고되었습니다 [6].
또 다른 가능성으로는, H. pylori 관련 독성 인자(virulent factors)인 CagA가 위암 발생에 중요한 역할을 할 수 있음이 제시되었습니다 [44, 45].
한편, HPG 환자에서 위암 발생과 관련된 염색질 재구성 인자(chromatin-remodeling factor)인 SWI/SNF 복합체의 이상(disorder)이 관여할 가능성이 있으며, 이는 HPG가 있는 위점막에서 나타날 수 있음이 보고되었습니다 [46].
반면, AIG는 벽세포(parietal cell) 파괴로 인한 가스트린(gastrin) 수치 상승을 통해 신경내분비 종양(neuroendocrine tumor, NET)의 발생을 유발할 가능성이 있습니다. 실제로, AIG 환자들의 혈청 가스트린 수치는 매우 높았으며(Tables 1 및 S2), AIG가 있는 위점막에서 신경내분비 종양 발생과 관련된 것으로 보고된 GAST 및 PAPPA2 유전자의 높은 발현이 관찰되었습니다(Fig. S1) [14]. 일반적으로 GAST 유전자는 전정부(pyloric gland)의 G세포에서 발현됩니다. 그러나 AIG 환자의 위체부 중간 영역에서도 GAST 발현이 높게 나타난 것은, AIG가 유도하는 전정부샘 화생(pyloric gland metaplasia) 및 장형화생(intestinal metaplasia)에 존재하는 G세포의 영향을 반영할 가능성이 있습니다 [2].
일부 AIG 샘플에서는 췌장 및 폐 관련 유전자들이 이소성 발현(ectopic expression)되는 현상이 관찰되었으나, 이는 HPG 샘플에서는 나타나지 않았습니다. PNLIP, CEL, CTRB1, CTRC와 같은 췌장 소화 관련 유전자들의 발현이 증가하였으며, 이는 말기 AIG(end-stage AIG)에서 췌장 선방세포(pancreatic acinar cell)의 화생이 위점막에서 관찰된다는 보고와 일치합니다 [2, 27, 47].
또한, 주요 췌장 전사 인자인 PDX1은 모든 샘플에서 발현되지 않았으며(signal intensity <25), 이는 이소성 발현이 다른 기전을 통해 조절될 가능성이 있음을 시사합니다 [48].
AIG에 의한 폐 분화(pulmonary differentiation)는 완전히 새로운 발견으로, 폐의 주요 전사 인자인 NKX2-1/TTF1 및 폐포액 분비 관련 유전자(SFTPB, SFTPC)가 함께 발현 증가하는 것이 확인되었습니다. 이러한 발현 변화는 AIG 환자의 내시경 검사 시 점막에서 점성이 강하고 끈적이며 밀집된 점액이 자주 관찰되는 현상과 관련이 있을 수 있습니다 [49].
이전에 보고된 연구에서 기저샘형 위선암(fundic gland-type gastric adenocarcinoma)이 SFTPB 및 SFTPC를 높은 수준으로 발현하며, 이는 NKX2-1/TTF1의 이소성 발현에 의해 조절될 수 있음이 밝혀졌습니다 [50].
이소성 유전자 발현은 단백질 수준에서도 확인되었으며, 이를 통해 AIG가 있는 위상피세포는 장뿐만 아니라 췌장 및 폐로도 전이(transdifferentiation)될 수 있는 잠재력을 가짐을 시사합니다.
비정상적인 분화가 발생하는 기전과 관련하여, 벽세포 파괴로 인한 환경적 pH 상승이 AIG가 있는 위점막의 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있습니다 [33, 34]. AIG와 HPG 모두에서 ATP4A 발현이 감소하고 환경적 pH가 상승하는 경향이 있지만, AIG에서의 산성 환경 감소(즉, pH 상승)는 더욱 두드러졌습니다. 특히, CDX2 및 기타 장 특이적 유전자를 자주 발현하는 위암 세포주에서 낮은 pH 환경에서 이들 유전자들의 발현이 억제되는 것이 관찰되었습니다. 따라서, 환경적 pH 변화가 AIG의 비정상적인 분화를 유도하는 중요한 기전일 가능성이 있습니다.
이 가설은 HPG의 경우에도 적용될 수 있습니다. HPG가 있는 위점막에서도 H. pylori 감염에 의한 만성 염증으로 인해 환경적 pH가 상승하는 것이 보고되었습니다 [51]. 따라서, 환경적 pH의 유의미한 상승이 위상피세포의 불안정한 분화의 초기 단계일 가능성이 있습니다.
연구의 한계점 및 향후 연구 방향
- AIG 특이적 유전자에 대한 면역조직화학 분석(immunohistochemistry)이 제한된 샘플에서만 수행되었습니다. AIG 환자의 보조 진단 마커(auxiliary diagnostic marker) 또는 종양 발생 위험 마커(risk marker)로서의 가능성을 평가하기 위해 대규모 코호트 연구(cohort study) 또는 전향적 연구(prospective study)가 필요합니다.
- 생검 샘플 내 다양한 위세포 및 염증세포들의 존재가 유전자 발현 프로파일 및 신호 전달 경로 분석을 어렵게 만듭니다. 따라서, 단일 세포 분석(single-cell analysis)을 통해 AIG가 세포 유형별로 유전자 조절에 미치는 영향을 보다 정확하게 평가하고, 비정상적인 분화 및 신경내분비 종양(NET) 발생 기전을 규명할 필요가 있습니다.
- AIG 및 정상 대조군이 모두 H. pylori 음성이며, 제균 치료를 받은 병력이 없다고 하더라도, 과거 H. pylori 감염 여부를 완전히 배제하기는 어렵습니다. 따라서, 보다 정밀한 진단 기법이 요구됩니다.
- 환경적 pH가 유전자 발현에 미치는 영향을 위암 세포주에서 평가하였으나, 정상 위상피세포 또는 오가노이드(organoid)를 이용한 추가 분석이 필요합니다.
결론
AIG는 장, 췌장, 폐 특이적 유전자의 전사를 활성화(transactivation)시키며, 이로 인해 다양한 전이(transdifferentiation) 현상이 발생합니다.
특히, AIG로 인한 환경적 pH 상승이 위점막의 비정상적인 분화를 유도하는 핵심 기전일 가능성이 높습니다.
** 그러면, PPI나 P-CAB 사용도 (장기? 단기?) 위 점막의 비정상적인 유전자 발현을 일으킬 수 있는가... ???
<Abstract>
Background
Autoimmune gastritis (AIG) is a prevalent chronic infammatory disease with oncogenic potential that causes destruction of parietal cells and severe mucosal atrophy. We aimed to explore the distinctive gene expression profles, activated signaling pathways, and their underlying mechanisms.
Methods
A comprehensive gene expression analysis was conducted using biopsy specimens from AIG, Helicobacter pylori-associated gastritis (HPG), and non-infammatory normal stomachs. Gastric cancer cell lines were cultured under acidic (pH 6.5) conditions to evaluate changes in gene expression.
Results
Gastric mucosa with AIG had a unique gene expression profle compared with that with HPG and normal mucosa, such as extensively low expression of ATP4A and high expression of GAST and PAPPA2, which are involved in neuroendocrine tumorigenesis. Additionally, the mucosa with AIG and HPG showed the downregulation of stomachspecifc genes and upregulation of small intestine-specifc genes; however, intestinal trans-diferentiation was much more prominent in AIG samples, likely in a CDX-dependent manner. Furthermore, AIG induced ectopic expression of pancreatic digestion-related genes, PNLIP, CEL, CTRB1, and CTRC; and a master regulator gene of the lung, NKX2-1/ TTF1 with alveolar fuid secretion-related genes, SFTPB and SFTPC. Mechanistically, acidic conditions led to the downregulation of master regulator and stemness control genes of small intestine, suggesting that increased environmental pH may cause abnormal intestinal diferentiation in the stomach.
Conclusions
AIG induces diverse trans-diferentiation in the gastric mucosa, characterized by the transactivation of genes specifc to the small intestine, pancreas, and lung. Increased environmental pH owing to AIG may cause abnormal diferentiation of the gastric mucosa.
Keywords: Autoimmune gastritis; Diverse trans-differentiation; Increased pH; Intestinal differentiation; Molecular epidemiology.
J Gastroenterol. 2024 Feb;59(2):95-108.
<Introduction>
자가면역 위염(AIG)에 대한 개요 및 유전자 발현 분석 연구
자가면역 위염(Autoimmune gastritis, AIG)은 위에서 벽세포(proton pump H⁺/K⁺-ATPase)에 대한 자가면역 반응이 특징적인 만성 염증성 질환이다 [1–3]. AIG의 유병률은 일반 인구에서 0.5~19.5% 보고된 바 있으며 [3], 질병이 진행됨에 따라 내인성 인자(intrinsic factor) 감소로 인한 악성 빈혈(pernicious anemia) 및 신경내분비 종양(neuroendocrine tumor, NET), 선암(adenocarcinoma)과 같은 악성 병변이 발생할 수 있다 [2,3].
병리학적으로 AIG는 벽세포의 파괴로 인한 위체부 점막의 심한 위축과 신경내분비 세포 과증식을 특징으로 하며, 이러한 세포는 크로모그라닌(chromogranin) 및 시냅토피신(synaptophysin)을 발현한다 [4,5]. 만성적인 위 점막 염증이 장기간 지속되면, AIG는 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 감염성 위염(HPG)과 유사한 장형 화생(intestinal metaplasia)을 유발할 수 있다 [2,3].
그러나 AIG와 HPG의 만성 염증에 대한 분자적 기전은 상당히 다르다. AIG는 자가면역 반응에 의해 유발되는 반면, HPG는 그람음성균인 헬리코박터 파일로리의 만성 감염과 그 독성 인자(예: Cag A, Vac A)에 의해 발생한다 [1–3]. 또한, AIG의 염증 반응을 매개하는 주요 면역세포는 자가반응성 T세포(autoreactive T cells)이며, HPG의 경우 대식세포(macrophages)와 호중구(neutrophils)와 같은 탐식세포(phagocytes)가 주된 역할을 한다 [2,3].
AIG에 대한 다수의 조직학적 연구가 이루어졌지만, 분자 수준에서의 연구는 제한적이며 [6,7], AIG 점막을 이용한 포괄적인 유전자 발현 분석 연구는 아직 보고된 바가 없다. 우리 연구팀은 이전 연구에서 AIG 점막이 HPG 및 정상 점막과는 독특한 DNA 메틸화 프로파일을 가진다는 사실을 보고한 바 있으며 [6], 이는 특정한 유전자 발현 양상이 존재할 가능성을 시사한다.
AIG의 특이적 유전자 발현 프로파일과 신호 전달 경로를 분석함으로써, AIG의 조직학적 변화, 면역 반응, 종양 발생과 같은 질병 표현형을 유추할 수 있다.
본 연구에서는 AIG 위 점막이 특정한 유전자 발현 패턴을 가지는지를 확인하고자 하였다. 이를 위해, AIG, HPG, 정상 위 점막을 대상으로 포괄적인 유전자 발현 분석을 수행하였으며, AIG에 의해 발생하는 유전자 발현 변화의 잠재적 기전도 탐색하였다.
<Methods>
Study design and tissue sample collection
본 연구는 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 감염이 없는 AIG 환자, HPG 환자, 그리고 내시경 생검을 시행한 건강한 자원자를 대상으로 한 다기관 연구(multicenter study)이다. 연구는 각 참여 기관의 윤리위원회(Institutional Review Board, IRB)의 승인을 받았으며, 2020년 3월 1일 일본 대학병원 의료 네트워크(UMIN)에 등록되었다 (UMIN000039528). 모든 생검 샘플은 환자로부터 서면 동의(written informed consent)를 받은 후 채취되었다.
환자 선정 및 생검 과정
연구에 등록되기 전에 내시경 평가(endoscopic evaluation)가 수행되었으며, AIG 및 HPG 환자의 샘플은 Kimura–Takemoto 분류법에서 O-II 또는 O-III로 정의되는 심한 개방형 위축(severe open-type atrophy)을 가진 환자만 포함하였다 [8] (Fig. 1).
Fig. 1 Typical endoscopic views of the gastric body and antrum in cases of autoimmune gastritis (AIG), H. pylori-associated gastritis (HPG), and non-infammatory normal mucosa (normal)
AIG와 HPG의 진단은 다음과 같은 방법으로 확인되었다.
참여자 중 위산 억제제(gastric acid suppressants) 사용 환자, 위절제술(gastrectomy) 병력이 있는 환자, 또는 H. pylori 제균 치료를 받은 환자는 포함되지 않았다. 모든 생검 샘플은 환자로부터 서면 동의를 받은 후 채취되었다.
샘플 채취 및 보관
모든 위 점막 샘플은 위체부(gastric body) 중부의 대만(greater curvature)에서 내시경 생검을 통해 채취되었으며, 이후 RNAlater (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)에 보관한 후 -80°C에서 저장되었다.
유전자 발현 분석을 위한 샘플 사용
포괄적인 유전자 발현 분석(comprehensive gene expression analysis):
조직학적 분석(histological analysis):
정량적 실시간 RT-PCR(quantitative real-time RT-PCR) 분석:
Table 1 Characteristics of cases used for comprehensive gene expression analyses
Comprehensive analysis of gene expression
유전자 발현 분석 방법
총 RNA는 RNeasy Mini Kit (Qiagen, CA, USA)를 사용하여 추출되었다. RNA의 순도(purity) 및 RNA 무결성 지수(RNA Integrity Number, RIN) 값은 NanoDrop1000 분광광도계(Thermo Fisher Scientific)와 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, CA, USA)를 이용하여 평가되었다.
포괄적인 유전자 발현 분석(comprehensive gene expression analysis)은 Agilent SurePrint G3 Human Gene Expression 8 × 60K v3 Microarray Kit (Agilent Technologies)를 사용하여 수행되었으며, 얻어진 데이터는 Gene Expression Omnibus (GSE233973) 데이터베이스에 저장되었다.
조직에서의 유전자 발현 데이터는 Genotype-Tissue Expression Project (GTEx) 데이터베이스 (https://www.gtexportal.org/)에서 획득되었다. 각 조직별 유전자 발현 수준의 평균(mean) 및 표준편차(Standard Deviation, SD)를 계산하였으며, 평균 + 2SD를 초과하는 상위 25개의 유전자를 조직 특이적 유전자(tissue-specific genes)로 정의하였다.
Gene expression informatics
1. 정량화(normalization) 및 전처리
2. 계층적 군집 분석(hierarchical clustering analysis)
3. 화산 그림(volcano plot) 시각화
4. 유전자 기능 분석(gene ontology analysis)
5. 조직 특이적 유전자 분석(tissue enrichment analysis)
6. 단백질 상호작용 네트워크 분석(protein–protein interaction, PPI network analysis)
Quantitative real‑time RT‑PCR
정량적 실시간 PCR(Quantitative RT-PCR, qRT-PCR)은 CFX Connect Real-Time Detection System (Bio-Rad, CA, USA)을 사용하여 진행되었으며,
유전자 전사체(gene transcript)의 복제 수(copy number)는 표준 DNA 샘플(standard DNA samples)의 증폭 결과와 비교하여 산출되었으며, GAPDH의 발현량을 기준으로 정규화(normalization)되었다.
대상 유전자(target genes) 및 GAPDH의 프라이머 서열(primer sequences)은 Table S2에 제시되었다.
Histological analysis
위 점막 생검 및 Sydney System 점수 분석
Immunohistochemistry
항체를 이용한 면역조직화학 염색
평가 과정
Cell culture
세포주 및 배양 조건
산성 배양액(pH 6.5) 준비
대조군 배양액(pH 8.0) 준비
공통 배양 조건
<Results>
임상적 특성
AIG displayed a unique gene expression profle from HPG in gastric mucosa
종합적인 유전자 발현 분석 결과
AIG 샘플에서
HPG 샘플에서
비 지도 클러스터 분석(unsupervised cluster analysis) 결과
특정 유전자 발현 변화
경로 분석(Pathway Enrichment Analysis) 결과
AIG 및 HPG 샘플에서
AIG 샘플에서 특징적으로 증가한 경로
HPG 샘플에서 특징적으로 증가한 경로
Fig. 2 Results of the comprehensive analysis of gene expression among the AIG (n=14), HPG (n=13), and normal samples (n=9). a Volcano plot analysis using the fold changes of gene expression levels between the normal and AIG samples, and the normal and HPG samples. The number of gene transcripts with twofold change and a small P-value (-log10 (P-values)>1.301) was higher in the AIG samples than in the HPG samples. b Unsupervised hierarchical cluster analysis using gene expression levels of the total 36 samples. Using the 2500 gene transcripts with the highest standard deviation (TOP SD), the AIG and HPG samples were clearly separated from the normal samples and were further separated into the AIG-enriched cluster and the HPG-enriched cluster. c Pathway enrichment analyses conducted via GSEA using the upregulated genes in the AIG and HPG samples. The top eight activated gene sets in the AIG and HPG samples are shown. NES—normalized enrichment score
Upregulation of small intestine‑specifc genes and downregulation of stomach‑specifc genes induced in gastric mucosa with AIG
위 점막에서의 비정상적인 장 분화(Abnormal Intestinal Differentiation) 분석 결과
조직 특이적 유전자 발현 분석 결과
Updated Sydney System(USS) 점수 기반의 조직학적 분석 결과
Caudal-type homeobox (CDX) 2 및 CDX1 발현 분석 결과
Fig. 3 Marked intestinal diferentiation in gastric mucosa with AIG. a Tissue enrichment analysis using top 50 upregulated genes in gastric mucosa with AIG and HPG. AIG showed higher enrichment of genes specifc to the duodenum and the small intestine compared with HPG. b Unsupervised hierarchical cluster analysis using gene expression levels of small intestine-specifc and stomach-specifc genes among the AIG (n=14), HPG (n=13), and normal samples (n=9). The AIG samples were clearly separated from the normal samples using small intestine and stomach-specifc genes, while a fraction of the HPG samples were grouped with the normal samples. c Immunostaining of MUC2 and MUC5AC using gastric mucosa with AIG. Scale bar: 100 μm. d Unsupervised hierarchical cluster analysis using gene expression levels of CDX signature genes, along with CDX2/1 expression (cutoff signal intensity=25). The AIG and HPG samples were clearly separated from the normal samples and were further separated into the AIG-enriched cluster and the HPG-enriched cluster. Moreover, all the AIG samples expressed CDX2/1, while the CDX negative HPG samples showed a unique cluster.
Gastric mucosa with AIG showed trans‑diferentiation into pancreas and lung
다음으로, AIG가 있는 점막에서 특이적으로 발현이 증가한 상위 25개의 유전자를 확인하였으며(Fig. 4a, 왼쪽), 이들은 정상 및 HPG 샘플에서 낮은 발현 수준(평균 신호 강도 <25)을 보였고, 정상과 HPG 샘플 간의 발현 변화도 최소한(<2배 변화)으로 나타났습니다(Table S10).
특히, AIG 특이적 유전자에는 췌장 소화 관련 유전자인 췌장 트라이아실글리세롤 리파아제(pancreatic triacylglycerol lipase, PNLIP) [21], 카복실 에스터 리파아제(carboxyl ester lipase, CEL) [22], 키모트립신 B1/C (chymotrypsin B1/C, CTRB1 및 CTRC) [23]가 포함되었습니다.
또한, 폐의 주요 조절 유전자인 NK2 호메오박스 1/갑상샘 전사인자 1 (NK2 homeobox 1/thyroid transcription factor 1, NKX2-1/TTF1) [24]과 폐포액 분비 관련 유전자인 서팩턴트 단백질 B 및 C (surfactant proteins B and C, SFTPB 및 SFTPC) [25]도 포함되었습니다.
더 나아가, AIG 특이적 유전자를 이용한 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크 분석에서 소화 및 폐포 라멜라체 관련 유전자 세트가 풍부하게 포함된 것으로 나타났습니다(Fig. 4a, 오른쪽). 일부 AIG 샘플에서는 이러한 유전자들이 실제로 발현되었으며(Figs. S3 및 S4), 췌장 및 폐 특이적 유전자(Tables S11 및 S12)를 사용하여 다른 샘플과 명확하게 구분되었습니다(Fig. 4b). 또한, 추가 샘플 세트를 대상으로 한 RT-PCR 분석을 통해 이러한 이소성 유전자 발현을 확인하였습니다(Figs. S5 및 S6, Table S1).
단백질 발현 수준과 분포를 확인하기 위해, AIG 샘플에서 새롭게 확인된 유전자 산물을 대상으로 면역조직화학 분석을 수행하였습니다(Figs. 4c 및 S7).
PNLIP와 BCL10, 즉 췌장 선방세포(pancreatic acinar cell) 마커 [26]는 AIG를 가진 위점막의 특정 영역에서 공동 발현되었으며, 이는 췌장 화생(pancreatic metaplasia) [27]이 발생하여 췌장 특이적 유전자 발현을 유도했음을 시사합니다.
반면, NKX2-1/TTF1의 확산된 발현이 AIG 위점막에서 관찰되었으며, 이와 함께 서팩턴트 단백질(SFTPB 및 SFTPC)의 발현도 확인되었습니다. 이는 AIG가 있는 위에서 보편적으로 폐 관련 전환(pulmonary trans-differentiation)이 일어남을 의미합니다.
종합적으로 볼 때, AIG가 있는 위점막은 HPG가 있는 점막보다 훨씬 다양한 형태의 세포 전환(trans-differentiation)을 겪는 것으로 보입니다.
또한, HPG 점막에서 특이적으로 발현이 증가한 유전자(Table S13)에는 사이토카인 IL6, CXCL8, CXCR2가 포함되었으며, 이는 다수의 염증 반응 관련 유전자 세트와 연관이 있었습니다(Fig. S8).
특히, CXCL8은 주로 대식세포(macrophages)에 의해 분비되며, 호중구(neutrophil) 이동을 유도하는 것으로 알려져 있습니다. 이는 조직학적 소견 [28] 및 앞서 설명한 경로 강화 분석(Fig. 2c)의 결과와도 일치합니다.
Fig. 4 Trans-diferentiation into the pancreas and lung in gastric mucosa with AIG. a Protein–protein interaction (PPI) network analysis using AIG-specifc genes. The observed networks (Network A and Network B) showed the enrichment of gene sets related to digestion and the alveolar lamellar body. FDR—false discovery rate. b Unsupervised hierarchical cluster analysis using gene expression levels of pancreas-specifc and lung-specifc genes among the AIG (n=14), HPG (n=13), and normal samples (n=9). A fraction of the AIG samples was clearly separated from the other samples. c Immunostaining of AIG-specifc genes related to abnormal diferentiation of the pancreas (PNLIP and BCL10) and lung (NKX2-1/TTF1, SFTPB, and SFTPC) using gastric mucosa with AIG. Scale bar: 100 μm
Environmental acidic condition possibly afects expression levels of intestine‑related genes
AIG가 유전자 발현에 미치는 영향을 탐색하기 위해 먼저 DNA 메틸화(DNA methylation)에 초점을 맞추었습니다. 이는 AIG가 있는 위점막에서 프로모터 CpG 섬(CpG islands, CGI)에서 비정상적인 DNA 메틸화가 발생함이 보고되었기 때문입니다 [6].
특히, 발현이 증가하거나 감소한 대부분의 유전자에는 프로모터 CGI가 존재하지 않았으며(Tables S4 및 S5), 이는 해당 유전자들이 TATA 박스(TATA box) 요소에 의해 조절됨을 시사합니다. 일반적으로 CGI에 의해 조절되는 유전자들은 기본적인 세포 기능에 필수적인 housekeeping 유전자 및 종양 억제 유전자를 포함합니다 [29–31]. 반면, TATA에 의해 조절되는 유전자들은 특정 환경적 조건과 자극에 따라 발현 수준이 조절되는 유도성 유전자(inducible genes)인 경우가 많습니다 [32].
따라서, 우리는 AIG가 있는 위점막에서 두드러지게 나타나는 환경적 변화에 주목하였습니다.
AIG에 의해 벽세포(parietal cells)가 파괴된 결과, ATP4A 및 ATP4B의 발현 수준이 AIG 샘플에서 HPG 샘플보다 현저하게 감소하였으며(Fig. S9 및 Tables S14 및 S15), AIG 위점막에서는 pH가 현저히 높은 것으로 보고되었습니다 [33, 34].
이에 따라, 우리는 환경적 pH 증가가 AIG 위점막에서 비정상적인 세포 전환(trans-differentiation)을 유도할 수 있다는 가설을 세웠습니다.
이 가설을 검증하기 위해, 위암 세포주(AGS, MKN74, MKN1, GCIY)를 산성 환경과 대조군 조건에서 배양한 후 유전자 발현 변화를 분석하였습니다.
그 결과, 산성 조건에서는 소장의 주요 조절 유전자(master regulator)인 CDX2 [17] 및 줄기세포 마커 유전자 LGR5 [35], ASCL2 [36], OLFM4 [37]의 발현이 감소하는 것으로 나타났습니다(Fig. 5a). 또한, 세포주 간 평균적인 소장 특이적 유전자 발현 변화 역시 산성 조건에서 감소하는 경향을 보였습니다(Fig. S10). 반면, AIG에서 확인된 췌장 및 폐 관련 유전자들의 발현에는 거의 변화가 없었습니다.
Fig. 5 Abnormal intestinal diferentiation by environmental acidic conditions. a Gene expression changes in gastric cancer cell lines (AGS, MKN74, MKN1, and GCIY). Acidic conditions downregulated the expression levels of a master regulator gene of the small intestine, CDX2, and stem marker genes, LGR5, ASCL2, and OLFM4. b Unsupervised hierarchical cluster analysis using gene expression levels of pancreas-specifc and lung-specifc genes among the AIG (n=14), HPG (n=13), and normal samples (n=9). The AIG and HPG samples were clearly separated from the normal samples and were further separated into the AIG-enriched cluster and the HPG enriched cluster.
<Discussion>
우리의 연구가 AIG로 인한 유전자 발현 변화를 종합적으로 분석한 최초의 보고라는 점에서 의의가 있습니다. AIG가 있는 위점막은 HPG 또는 비염증성 정상 점막과 비교했을 때 독특한 유전자 발현 프로파일을 나타냅니다.
특히, AIG에서는 잘 알려진 장형화생(intestinal metaplasia)뿐만 아니라 비정상적인 췌장 및 폐 분화가 관찰되었습니다. 또한, AIG로 인해 환경적 pH가 증가하면 위점막에서 비정상적인 분화를 유도할 가능성이 있습니다.
AIG와 HPG 모두 위에서 장의 이소성 분화를 유발하는 만성 염증을 동반하지만, 본 연구 결과는 AIG가 있는 위점막에서 HPG보다 장 특이적 유전자 발현이 더 두드러짐을 보여줍니다. 그러나, HPG는 위 전정부에서 시작되어 체부로 확산되며, 주로 전정부에서 장형화생을 유발합니다.
AIG와 HPG 간 유전자 발현 차이에 대한 염증 부위의 영향을 줄이기 위해, 본 연구에서는 AIG와 HPG 모두에서 심한 개방형 위축(severe open-type atrophy) 상태의 점막을 분석 대상으로 선정하였으며, 위 체부 중간부에서 채취한 생검 샘플을 사용하였습니다.
그 결과, 유전자 발현 수준에서 관찰된 AIG와 HPG 간 차이를 반영하듯, AIG 샘플에서 HPG 샘플보다 장형화생의 발생률이 더 높은 것으로 나타났습니다.
장형화생은 위암 발생의 위험 요인으로 간주됩니다. 그러나, H. pylori 감염이 없는 AIG 환자의 경우, HPG 환자보다 위암 발생률이 낮다는 보고와는 대조적인 결과를 보였습니다 [3]. 또한, AIG에서 발생한 위암은 주로 위형 점액(gastric-type mucin)을 발현하는 경향이 있었습니다 [38].
이러한 차이를 설명하는 가설 중 하나는, AIG 점막에서는 HPG 점막보다 발암과 관련된 비정상적인 DNA 메틸화를 유도하는 염증 반응의 정도가 낮기 때문일 가능성입니다 [39–43]. 차등 발현 유전자(differentially expressed genes)를 활용한 경로(enrichment) 분석 결과, HPG가 있는 위점막에서 대식세포-호중구 축(macrophage–neutrophil axis)의 염증 반응과 관련된 유전자 세트가 더 풍부하게 발현되었으며, HPG가 있는 위점막에서 AIG보다 비정상적인 DNA 메틸화가 더 많이 보고되었습니다 [6].
또 다른 가능성으로는, H. pylori 관련 독성 인자(virulent factors)인 CagA가 위암 발생에 중요한 역할을 할 수 있음이 제시되었습니다 [44, 45].
한편, HPG 환자에서 위암 발생과 관련된 염색질 재구성 인자(chromatin-remodeling factor)인 SWI/SNF 복합체의 이상(disorder)이 관여할 가능성이 있으며, 이는 HPG가 있는 위점막에서 나타날 수 있음이 보고되었습니다 [46].
반면, AIG는 벽세포(parietal cell) 파괴로 인한 가스트린(gastrin) 수치 상승을 통해 신경내분비 종양(neuroendocrine tumor, NET)의 발생을 유발할 가능성이 있습니다. 실제로, AIG 환자들의 혈청 가스트린 수치는 매우 높았으며(Tables 1 및 S2), AIG가 있는 위점막에서 신경내분비 종양 발생과 관련된 것으로 보고된 GAST 및 PAPPA2 유전자의 높은 발현이 관찰되었습니다(Fig. S1) [14]. 일반적으로 GAST 유전자는 전정부(pyloric gland)의 G세포에서 발현됩니다. 그러나 AIG 환자의 위체부 중간 영역에서도 GAST 발현이 높게 나타난 것은, AIG가 유도하는 전정부샘 화생(pyloric gland metaplasia) 및 장형화생(intestinal metaplasia)에 존재하는 G세포의 영향을 반영할 가능성이 있습니다 [2].
일부 AIG 샘플에서는 췌장 및 폐 관련 유전자들이 이소성 발현(ectopic expression)되는 현상이 관찰되었으나, 이는 HPG 샘플에서는 나타나지 않았습니다. PNLIP, CEL, CTRB1, CTRC와 같은 췌장 소화 관련 유전자들의 발현이 증가하였으며, 이는 말기 AIG(end-stage AIG)에서 췌장 선방세포(pancreatic acinar cell)의 화생이 위점막에서 관찰된다는 보고와 일치합니다 [2, 27, 47].
또한, 주요 췌장 전사 인자인 PDX1은 모든 샘플에서 발현되지 않았으며(signal intensity <25), 이는 이소성 발현이 다른 기전을 통해 조절될 가능성이 있음을 시사합니다 [48].
AIG에 의한 폐 분화(pulmonary differentiation)는 완전히 새로운 발견으로, 폐의 주요 전사 인자인 NKX2-1/TTF1 및 폐포액 분비 관련 유전자(SFTPB, SFTPC)가 함께 발현 증가하는 것이 확인되었습니다. 이러한 발현 변화는 AIG 환자의 내시경 검사 시 점막에서 점성이 강하고 끈적이며 밀집된 점액이 자주 관찰되는 현상과 관련이 있을 수 있습니다 [49].
이전에 보고된 연구에서 기저샘형 위선암(fundic gland-type gastric adenocarcinoma)이 SFTPB 및 SFTPC를 높은 수준으로 발현하며, 이는 NKX2-1/TTF1의 이소성 발현에 의해 조절될 수 있음이 밝혀졌습니다 [50].
이소성 유전자 발현은 단백질 수준에서도 확인되었으며, 이를 통해 AIG가 있는 위상피세포는 장뿐만 아니라 췌장 및 폐로도 전이(transdifferentiation)될 수 있는 잠재력을 가짐을 시사합니다.
비정상적인 분화가 발생하는 기전과 관련하여, 벽세포 파괴로 인한 환경적 pH 상승이 AIG가 있는 위점막의 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있습니다 [33, 34]. AIG와 HPG 모두에서 ATP4A 발현이 감소하고 환경적 pH가 상승하는 경향이 있지만, AIG에서의 산성 환경 감소(즉, pH 상승)는 더욱 두드러졌습니다. 특히, CDX2 및 기타 장 특이적 유전자를 자주 발현하는 위암 세포주에서 낮은 pH 환경에서 이들 유전자들의 발현이 억제되는 것이 관찰되었습니다. 따라서, 환경적 pH 변화가 AIG의 비정상적인 분화를 유도하는 중요한 기전일 가능성이 있습니다.
이 가설은 HPG의 경우에도 적용될 수 있습니다. HPG가 있는 위점막에서도 H. pylori 감염에 의한 만성 염증으로 인해 환경적 pH가 상승하는 것이 보고되었습니다 [51]. 따라서, 환경적 pH의 유의미한 상승이 위상피세포의 불안정한 분화의 초기 단계일 가능성이 있습니다.
연구의 한계점 및 향후 연구 방향
결론
AIG는 장, 췌장, 폐 특이적 유전자의 전사를 활성화(transactivation)시키며, 이로 인해 다양한 전이(transdifferentiation) 현상이 발생합니다.
특히, AIG로 인한 환경적 pH 상승이 위점막의 비정상적인 분화를 유도하는 핵심 기전일 가능성이 높습니다.
** 그러면, PPI나 P-CAB 사용도 (장기? 단기?) 위 점막의 비정상적인 유전자 발현을 일으킬 수 있는가... ???
<Abstract>
Background
Autoimmune gastritis (AIG) is a prevalent chronic infammatory disease with oncogenic potential that causes destruction of parietal cells and severe mucosal atrophy. We aimed to explore the distinctive gene expression profles, activated signaling pathways, and their underlying mechanisms.
Methods
A comprehensive gene expression analysis was conducted using biopsy specimens from AIG, Helicobacter pylori-associated gastritis (HPG), and non-infammatory normal stomachs. Gastric cancer cell lines were cultured under acidic (pH 6.5) conditions to evaluate changes in gene expression.
Results
Gastric mucosa with AIG had a unique gene expression profle compared with that with HPG and normal mucosa, such as extensively low expression of ATP4A and high expression of GAST and PAPPA2, which are involved in neuroendocrine tumorigenesis. Additionally, the mucosa with AIG and HPG showed the downregulation of stomachspecifc genes and upregulation of small intestine-specifc genes; however, intestinal trans-diferentiation was much more prominent in AIG samples, likely in a CDX-dependent manner. Furthermore, AIG induced ectopic expression of pancreatic digestion-related genes, PNLIP, CEL, CTRB1, and CTRC; and a master regulator gene of the lung, NKX2-1/ TTF1 with alveolar fuid secretion-related genes, SFTPB and SFTPC. Mechanistically, acidic conditions led to the downregulation of master regulator and stemness control genes of small intestine, suggesting that increased environmental pH may cause abnormal intestinal diferentiation in the stomach.
Conclusions
AIG induces diverse trans-diferentiation in the gastric mucosa, characterized by the transactivation of genes specifc to the small intestine, pancreas, and lung. Increased environmental pH owing to AIG may cause abnormal diferentiation of the gastric mucosa.
Keywords: Autoimmune gastritis; Diverse trans-differentiation; Increased pH; Intestinal differentiation; Molecular epidemiology.