Digestion. 2025 Apr 12. doi: 10.1159/000545454.
Introduction
일본에서 위축성 위염의 주요 원인은 헬리코박터 파일로리 감염이다[1]. 그러나 일부 위축성 위염은 H. pylori 감염과 관련이 없다. 전형적인 병리학적 상태로는 자가면역성 위염(AIG)이 있다. AIG는 과거에는 드물다고 여겨졌지만[2], 최근 연구 결과에 따르면 내시경을 받은 환자의 약 0.5%가 AIG를 앓고 있는 것으로 나타났다[3]. 내시경을 통한 위암 선별검사에서 위암 발견율은 0.1~0.3%로 보고되므로, AIG는 위암보다 더 자주 접하게 되는 질환이다. 이러한 사실에 근거해 AIG는 모든 임상의가 인지해야 할 질병으로 여겨지고 있다.
AIG의 주요 병리 기전은 위 벽세포의 양성자 펌프에 대한 자가항원에 반응하는 자가면역 반응이며, 이 과정에 세포매개 면역이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다[4]. 우리는 이전 연구에서 AIG 환자의 혈청이 웨스턴 블롯법을 통해 주로 돼지의 H⁺,K⁺-ATPase β-소단위와 교차 반응함을 확인한 바 있다[5]. 인간과 돼지의 H⁺,K⁺-ATPase는 높은 상동성을 가지기 때문에, 임상에서 AIG를 진단하는 데 있어 이 펌프에 대한 자가항체(위벽세포항체, APCA)를 평가하는 것이 중요하다.
2023년에는 일본소화기내시경학회 관련 워크숍 및 자가면역성 위염연구회 위원회와 관련된 “A형 위염 진단기준 확립 연구회”에 의해 일본의 AIG 진단기준이 마련되었다[6]. 이 기준에 따르면, 내시경 소견, 조직병리 소견, 또는 그 둘 모두에서 AIG에 합당한 소견을 보이며, 위 자가항체(APCA, 내인자항체 또는 둘 다)가 양성인 환자는 AIG로 확진된다[6]. 또한, 기존의 형광항체법(FA)에서 10배 이상 희석에서 양성 반응을 보이는 경우도 AIG로 간주된다. 그러나 이 방법은 재현성이 낮고, AIG 진단에서 특이도가 떨어진다는 한계가 있다[6]. 따라서 이러한 기준 중 10배 희석 양성이라는 기준도 위양성을 고려하여 향후 변경될 가능성이 있다고 언급되어 있다. 또 다른 한계로는 일본의 국민건강보험제도에서는 APCA 자가항체 검사를 보장하지 않는다는 점이다.
이러한 배경에 따라, 임상에서 AIG 진단에 기여할 수 있는 새로운 검사법의 개발은 시급한 과제이다. 지금까지 APCA 역가를 측정하는 유일한 방법은 FA법뿐이었는데, 이 방법은 환자 혈청을 희석해 슬라이드 위의 쥐 신장과 위 조직의 동결절편에 반응시키는 방식이다. 우리는 과거에 돼지의 H⁺,K⁺-ATPase를 이용한 효소면역측정법(ELISA) 기반의 APCA 평가 시스템을 보고한 바 있으나[5,7], 당시의 검사법은 비특이 반응이 강하여 AIG 진단에 적용하는 데 어려움이 있었다.
우리는 인간 H⁺,K⁺-ATPase의 β-소단위의 재조합 단백질을 제작하고, 이를 라텍스 응집법(LA법)에 적용한 새로운 APCA 측정법을 확립하였다. LA법은 임상 진단 시약의 측정 방법 중 하나로, 항원이 라텍스 입자에 결합되어 있고 이 항원이 검체 내 항체와 반응하여 입자가 응집되는 원리이다. 이 응집으로 인한 흡광도 변화를 측정하여 항체를 검출한다. LA법은 자동화된 생화학 분석기를 이용하여 측정할 수 있어, 검사 처리량과 작업 효율 면에서 유리하며 신속한 검사에 크게 기여할 것으로 기대된다[8]. 우리는 새롭게 확립한 APCA 측정 시약(LA법)의 진단 성능을 기존의 FA법과 비교하였다.
Methods
Study design
이번 후향적 연구는 히로시마대학교를 중심으로 가와사키의과대학, 후지에다시립종합병원, 가코가와중앙시립병원, 그리고 후지필름 주식회사와의 협력 하에 수행되었다. 본 연구는 히로시마대학교 기관윤리심의위원회(IRB) 및 윤리위원회(No. E2022-0257-02)의 승인을 받았으며, 헬싱키 선언 및 그 이후 개정 사항을 준수하여 시행되었다.
Enrolled patients
AIG 그룹과 대조군의 특성은 표 1에 요약되어 있다. 측정에 사용된 검체는 AIG 환자 127명(남성 49명, 평균 연령 65.9세)과 대조군 129명(남성 81명, 평균 연령 66.1세)의 혈청 샘플이었다. AIG 환자는 기존 방법으로 측정된 APCA 역가 결과에 관계없이 조직학적 및 내시경적으로 AIG로 진단된 사례였다. 모든 AIG 환자에서는 체부(corpus)와 전정부(antrum)에서 생검을 실시하였다. HE 염색 슬라이드는 전문가 병리의가 기존에 보고된 진단 기준[6]에 따라 평가하였으며, 필요 시 chromogranin A 염색 또는 gastrin 면역조직화학 염색을 추가로 시행하였다.
대조군은 다음 중 하나의 조건을 충족한 사례로 정의하였다: (1) 내시경 검사에서 위 체부에 위축성 위염이 없는 경우(Kimura-Takemoto 분류 기준으로 C0/1)[9], 또는 (2) 교토 분류 시스템[10,11]에 따라 H. pylori 관련 위염의 전형적인 내시경 소견을 보이고, 내시경적으로 AIG가 부정된 경우.
포함 기준은 다음과 같다: (1) 18세 이상인 사례, (2) 2015년 1월 1일부터 2023년 1월 31일 사이에 공복 혈액을 채취하고 국내 키트를 이용하여 혈청 항-H. pylori 항체 역가를 측정한 사례.
제외 기준은 다음과 같다: (1) 중증 간 또는 신장 기능 장애가 있는 사례, (2) 악성 신생물 치료 중인 사례, (3) 상부 위장관 절제술을 받은 사례, (4) 면역 이상이 있는 사례, (5) 본 연구 참여를 거부한 사례, (6) 임산부, (7) 연구책임자 또는 참여 연구자가 본 연구 대상자로 부적합하다고 판단한 사례.
H. pylori 감염 여부는 혈청 항-H. pylori 항체 역가와 내시경 소견을 기반으로 판정하였다. 감염 상태의 판단이 어려운 경우에는 대변 항원 검사를 추가로 실시하였다. AIG 환자 중 H. pylori 감염 사례는 3건(2.4%)이었고, 대조군에서는 24건(18.6%)이었다(표 1).
Measurement of APCA titers
등록된 환자의 혈청은 아래에 설명된 기존의 형광항체법(FA)과 새로운 라텍스 응집법(LA)을 사용하여 APCA 역가를 평가하는 데 사용되었다.
LA method
H⁺,K⁺-ATPase는 α-소단위와 β-소단위로 구성되며, 대부분의 위벽세포항체는 β-소단위와 반응한다[5]. 따라서 인간 H⁺,K⁺-ATPase β-소단위의 세포외 도메인(아미노산 서열 64-291)의 N-말단 쪽에 His 태그를 삽입하여 발현 벡터를 제작하였다(Fig. 1).
Fig. 1. The schematic diagram of H+ , K+ -ATPase is shown, and the numbers indicate the amino acid number of the β-subunit.
Sf9 세포는 PSFM-J1 배지(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japan) 100 µL에 접종되었으며, 목적 서열이 삽입된 벡터 pIEx-4 DNA (Novagen, Merck KGaA, Darmstadt, Germany) 2 µg 및 baculovirus DNA (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) 90 ng과 함께 27°C에서 7일간 배양되었다. 배양 후 상층액을 수집하여 니켈 정제를 통해 항원을 정제하였다. 항원은 2~10°C에서 하룻밤 동안 폴리스티렌 라텍스와 반응시켰다. 이후 항원이 감작된 라텍스를 원심분리한 뒤 Good’s buffer(pH 7.00)에 현탁시켜 0.2% 농도로 만든 라텍스 시약으로 사용하였다.
시약 1 (R1)은 1.0% NaCl, 0.09% NaN3, 0.1% 우혈청알부민(Merck Millipore, USA-MA), 18% 공중합체 기반 응집 증강제(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japan)를 포함한 pH 7.0의 Good’s buffer였다. 분석에는 자동 생화학 분석기(JCA-BM9130, JEOL Ltd., Tokyo, Japan)가 사용되었다. 측정 과정에서는 45 μL의 R1과 1.5 μL의 혈청 샘플을 혼합하여 37°C에서 5분간 반응시킨 뒤, 15 μL의 라텍스 시약을 추가하고 다시 37°C에서 5분간 반응시켜 805 nm 파장에서의 흡광도 변화를 측정하였다.
FA method
FA 측정은 SRL 주식회사와 BML 주식회사에서 수행되었다. 분석에 사용된 컷오프 값은 해당 회사들이 제공한 10배 희석 기준이었다.
Statistics
모든 임상병리학적 특성은 연속형 자료의 비교를 위해 Wilcoxon 순위합 검정을 사용하여 분석하였다. P 값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 모든 통계 분석은 JMP 소프트웨어 버전 16 (SAS International Inc., Cary, NC, USA)을 사용하여 수행되었다.
Results
Antibody titers evaluated by FA and LA methods.
127명의 AIG 환자와 129명의 대조군 혈청 샘플에 대해 FA 방법과 LA 방법을 이용하여 항체 역가를 측정하였다. LA 방법에 대해 수신자 조작 특성(ROC) 분석을 수행하였다(Fig. 2).
Fig. 2. Receiver operating characteristic (ROC) analysis of latex agglutination (LA) method. Number in parentheses indicate area under the curve (AUC).
LA 방법에서 산출된 AUC는 0.942로, 매우 우수한 것으로 평가되었다[12]. LA 방법의 컷오프 값은 Youden 지수를 이용해 계산되었으며, 10 U/mL로 정의되었다. 두 검사 방법 모두 AIG 그룹의 혈청에서 대조군에 비해 유의하게 높은 항체 역가를 보였다(Fig. 3).
Fig. 3. Autoimmune gastritis (AIG) sera (n=127) and control sera (n=129) measured by latex agglutination (LA) and fluorescent antibody (FA) methods. P values were calculated by Wilcoxon’s rank-sum test. The center line of the box indicates the median of data; the bottom and top lines indicate the 25th and 75th quartiles. Lines extending from the box indicate 1.5× the quartile range from the top and bottom of the box.
Sensitivity and specificity of each method
각 방법의 통계 지표는 표 2에 요약되어 있다. 새로운 LA 방법의 민감도와 특이도는 각각 93.7%와 95.4%로 계산되었다. 반면, 기존의 FA 방법은 SRL 주식회사와 BML 주식회사가 제시한 컷오프 기준인 10배 희석 조건에서 분석하였을 때, 민감도는 99.2%, 특이도는 41.1%로 계산되었다. 전체 정확도는 LA 방법에서 94.5%였으며, 기존 FA 방법에서는 69.9%에 불과하였다.
Discussion
일본에서는 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 감염의 유병률이 현저히 감소함에 따라 상부 위장관 질환의 역학이 크게 변화하고 있다[13]. 최근 AIG(자가면역성 위염)는 소화기내과 분야에서 중요한 질환으로 인식되고 있으며, 위암 및 신경내분비종양의 고위험 요인일 뿐만 아니라 악성 빈혈, 신경계 질환 및 자가면역 다내분비증후군(autoimmune polyendocrine syndrome)과 같은 전신 질환과도 관련된 병리적 상태이다[14]. AIG는 일본에서 드물지 않기 때문에[15], 정확한 진단이 최근 임상 현장에서 매우 중요해지고 있다.
건강검진 등 대규모 검사에서 AIG를 진단하기 위해서는 혈청학적 선별검사가 필수적이다. 그러나 일본에서는 AIG를 객관적이고 재현성 있게 진단할 수 있는 우수한 검사법이 아직 없다. 유럽 헬리코박터 및 마이크로바이오타 연구 그룹(European Helicobacter and Microbiota Study Group)의 가이드라인은 AIG 진단을 위해 APCA를 포함한 혈청 마커 측정의 중요성을 강조하고 있다[16]. 비록 AIG에 대한 엄격한 진단 기준이 확립되어 있지는 않지만, 혈청 APCA 수치와 조직학적 소견은 진단의 중요한 근거로 간주된다[17,18].
위암 등 합병증의 유병률을 조사할 때는 H. pylori 감염 여부를 최대한 구분하는 것이 중요하다[19]. 그러나 AIG 진단 정확도를 조사하는 데 있어서 H. pylori 감염 사례가 포함된다고 해서 연구의 타당성이 손상되는 것은 아니다. 오히려 H. pylori 감염이 있는 경우에도 AIG를 진단할 수 있다는 점은 의미 있는 일이다[6].
또한, 혈청 가스트린은 AIG 진단에 중요한 검사 항목 중 하나이나[20], AIG를 포함한 체부 위축성 위염의 중증 사례에서는 높은 수치를 보이지 않을 수 있다[21]. 따라서 혈청 가스트린 수치는 일본의 진단 지침에는 포함되어 있지 않다. 가스트린 수치는 산분비 억제제 복용, 음식 섭취, 신장 기능 장애 등 다양한 요인의 영향을 받는다[20]. 실제로 본 연구의 AIG 환자에서도 혈청 가스트린 수치는 반드시 매우 높게 나타나지는 않았다(자료 미제시). 또 다른 중요한 문제는 일본과 유럽 간의 가스트린 측정법 차이로 인해[22], 혈청 가스트린 수치를 직접 비교하기 어려운 점이다.
이전에는 돼지 위에서 추출한 항원을 사용하여 APCA 측정 시스템을 개발하고 보고한 바 있다[5]. 이 측정법에서는 AIG 환자의 혈청 수치가 유의하게 높았지만, 배경 수치도 높아 AIG와 대조군을 구분하는 데에는 충분하지 않았다 (미발표 자료). 또한 항원으로 사용한 돼지의 양성자 펌프의 안정적인 공급이 어려웠던 점도 제한 사항이었다. 따라서 이번 연구의 첫 번째 과제는 안정적으로 공급 가능한 인간 유래 양성자 펌프 항원을 확보하는 것이었다. 우리는 인간 H+,K+-ATPase β-소단위체의 세포외 도메인에서 재조합 단백질을 생산하고, 이를 항원으로 사용한 측정 시스템의 유용성을 확인함으로써 이 문제를 해결했다. 이 재조합 항원을 사용함으로써 비특이적 반응을 최소화한 안정적인 공급이 가능한 LA 측정 키트를 구축할 수 있었다.
이번 연구 결과는 LA 시스템이 기존의 FA 방법보다 우수함을 보여주며, 본 측정법이 AIG 진단을 위한 새로운 검사 시스템임을 나타낸다. 혈청학적 검사법은 임상 현장에서 필수적이며, 특히 대규모 선별검사에서 유용하다. 선별검사에서는 진단의 특이도가 매우 중요하다는 점을 강조해야 한다. 본 연구에서는 새로운 LA 방법이 기존 FA 방법보다 뛰어난 진단 특이도를 가졌음을 입증했다(LA: 95.4% vs FA: 41.1%). 또한 높은 정확도(LA: 94.5% vs FA: 69.9%)는 AIG 진단에서 LA 방법의 유용성을 확인시켜준다.
하지만 해결해야 할 몇 가지 제한점이 있다. 본 연구는 후향적 연구로, AIG를 진단할 당시 이미 APCA가 측정되어 있어, 이 결과가 AIG 진단에 영향을 미쳤을 가능성이 있다. 또한 대조군 내에 조기 단계 AIG 환자가 포함되어 있었을 가능성도 있다. 조기 AIG는 조직 검사로만 진단되는 경우가 많으며[23,24], 모든 대조군에서 조직 검사가 이루어진 것은 아니다. 더불어, 정확도는 분석에 포함된 사례 수에 영향을 받기 때문에 이번 결과는 절대적인 수치가 아닌 상대적인 수치로 해석할 필요가 있다. 이러한 제한점은 향후 대규모 전향적 연구를 통해 극복할 수 있을 것이다.
결론적으로, 우리는 AIG 진단에 유용한 새로운 APCA 측정 시스템을 개발하였다. 본 측정 시스템이 의료 현장에 도입됨으로써 AIG에 대한 추가 연구와 임상 진단이 더욱 활성화될 것으로 기대된다.
<Abstract >
Introduction: Recent findings revealed that autoimmune gastritis (AIG) is not rare in Japan. Therefore, the accurate diagnosis of AIG is essential in upper gastrointestinal practice. Diagnostic criteria for AIG were established in 2023; however, the conventional fluorescent antibody (FA) method for anti-parietal cell antibody titer (APCA) measurements has low accuracy and is clinically problematic.
Methods: We developed a latex agglutination (LA) method using a new human-derived antigen. Samples subjected to measurements were sera from AIG cases (127 cases, 49 males, average age 65.9 years) and control cases (129 cases, 81 males, average age 66.1 years) provided by the main facility and three affiliated facilities in Japan. APCA in whole serum was measured using the FA and LA methods.
Results: The diagnostic ability of AIG using the FA method was as follows: sensitivity of 99.2%, specificity of 41.1%, and an overall agreement rate of 69.9%, with low specificity previously being reported. On the other hand, the new LA method had good diagnostic performance with sensitivity of 93.7%, specificity of 95.4%, and an overall agreement rate of 94.5%.
Conclusion: We developed a new APCA measurement system that will contribute to the accurate diagnosis of AIG. The use of this measurement system in clinical practice will facilitate the diagnosis and treatment of AIG.
Digestion. 2025 Apr 12. doi: 10.1159/000545454.
Introduction
일본에서 위축성 위염의 주요 원인은 헬리코박터 파일로리 감염이다[1]. 그러나 일부 위축성 위염은 H. pylori 감염과 관련이 없다. 전형적인 병리학적 상태로는 자가면역성 위염(AIG)이 있다. AIG는 과거에는 드물다고 여겨졌지만[2], 최근 연구 결과에 따르면 내시경을 받은 환자의 약 0.5%가 AIG를 앓고 있는 것으로 나타났다[3]. 내시경을 통한 위암 선별검사에서 위암 발견율은 0.1~0.3%로 보고되므로, AIG는 위암보다 더 자주 접하게 되는 질환이다. 이러한 사실에 근거해 AIG는 모든 임상의가 인지해야 할 질병으로 여겨지고 있다.
AIG의 주요 병리 기전은 위 벽세포의 양성자 펌프에 대한 자가항원에 반응하는 자가면역 반응이며, 이 과정에 세포매개 면역이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다[4]. 우리는 이전 연구에서 AIG 환자의 혈청이 웨스턴 블롯법을 통해 주로 돼지의 H⁺,K⁺-ATPase β-소단위와 교차 반응함을 확인한 바 있다[5]. 인간과 돼지의 H⁺,K⁺-ATPase는 높은 상동성을 가지기 때문에, 임상에서 AIG를 진단하는 데 있어 이 펌프에 대한 자가항체(위벽세포항체, APCA)를 평가하는 것이 중요하다.
2023년에는 일본소화기내시경학회 관련 워크숍 및 자가면역성 위염연구회 위원회와 관련된 “A형 위염 진단기준 확립 연구회”에 의해 일본의 AIG 진단기준이 마련되었다[6]. 이 기준에 따르면, 내시경 소견, 조직병리 소견, 또는 그 둘 모두에서 AIG에 합당한 소견을 보이며, 위 자가항체(APCA, 내인자항체 또는 둘 다)가 양성인 환자는 AIG로 확진된다[6]. 또한, 기존의 형광항체법(FA)에서 10배 이상 희석에서 양성 반응을 보이는 경우도 AIG로 간주된다. 그러나 이 방법은 재현성이 낮고, AIG 진단에서 특이도가 떨어진다는 한계가 있다[6]. 따라서 이러한 기준 중 10배 희석 양성이라는 기준도 위양성을 고려하여 향후 변경될 가능성이 있다고 언급되어 있다. 또 다른 한계로는 일본의 국민건강보험제도에서는 APCA 자가항체 검사를 보장하지 않는다는 점이다.
이러한 배경에 따라, 임상에서 AIG 진단에 기여할 수 있는 새로운 검사법의 개발은 시급한 과제이다. 지금까지 APCA 역가를 측정하는 유일한 방법은 FA법뿐이었는데, 이 방법은 환자 혈청을 희석해 슬라이드 위의 쥐 신장과 위 조직의 동결절편에 반응시키는 방식이다. 우리는 과거에 돼지의 H⁺,K⁺-ATPase를 이용한 효소면역측정법(ELISA) 기반의 APCA 평가 시스템을 보고한 바 있으나[5,7], 당시의 검사법은 비특이 반응이 강하여 AIG 진단에 적용하는 데 어려움이 있었다.
우리는 인간 H⁺,K⁺-ATPase의 β-소단위의 재조합 단백질을 제작하고, 이를 라텍스 응집법(LA법)에 적용한 새로운 APCA 측정법을 확립하였다. LA법은 임상 진단 시약의 측정 방법 중 하나로, 항원이 라텍스 입자에 결합되어 있고 이 항원이 검체 내 항체와 반응하여 입자가 응집되는 원리이다. 이 응집으로 인한 흡광도 변화를 측정하여 항체를 검출한다. LA법은 자동화된 생화학 분석기를 이용하여 측정할 수 있어, 검사 처리량과 작업 효율 면에서 유리하며 신속한 검사에 크게 기여할 것으로 기대된다[8]. 우리는 새롭게 확립한 APCA 측정 시약(LA법)의 진단 성능을 기존의 FA법과 비교하였다.
Methods
Study design
이번 후향적 연구는 히로시마대학교를 중심으로 가와사키의과대학, 후지에다시립종합병원, 가코가와중앙시립병원, 그리고 후지필름 주식회사와의 협력 하에 수행되었다. 본 연구는 히로시마대학교 기관윤리심의위원회(IRB) 및 윤리위원회(No. E2022-0257-02)의 승인을 받았으며, 헬싱키 선언 및 그 이후 개정 사항을 준수하여 시행되었다.
Enrolled patients
AIG 그룹과 대조군의 특성은 표 1에 요약되어 있다. 측정에 사용된 검체는 AIG 환자 127명(남성 49명, 평균 연령 65.9세)과 대조군 129명(남성 81명, 평균 연령 66.1세)의 혈청 샘플이었다. AIG 환자는 기존 방법으로 측정된 APCA 역가 결과에 관계없이 조직학적 및 내시경적으로 AIG로 진단된 사례였다. 모든 AIG 환자에서는 체부(corpus)와 전정부(antrum)에서 생검을 실시하였다. HE 염색 슬라이드는 전문가 병리의가 기존에 보고된 진단 기준[6]에 따라 평가하였으며, 필요 시 chromogranin A 염색 또는 gastrin 면역조직화학 염색을 추가로 시행하였다.
대조군은 다음 중 하나의 조건을 충족한 사례로 정의하였다: (1) 내시경 검사에서 위 체부에 위축성 위염이 없는 경우(Kimura-Takemoto 분류 기준으로 C0/1)[9], 또는 (2) 교토 분류 시스템[10,11]에 따라 H. pylori 관련 위염의 전형적인 내시경 소견을 보이고, 내시경적으로 AIG가 부정된 경우.
포함 기준은 다음과 같다: (1) 18세 이상인 사례, (2) 2015년 1월 1일부터 2023년 1월 31일 사이에 공복 혈액을 채취하고 국내 키트를 이용하여 혈청 항-H. pylori 항체 역가를 측정한 사례.
제외 기준은 다음과 같다: (1) 중증 간 또는 신장 기능 장애가 있는 사례, (2) 악성 신생물 치료 중인 사례, (3) 상부 위장관 절제술을 받은 사례, (4) 면역 이상이 있는 사례, (5) 본 연구 참여를 거부한 사례, (6) 임산부, (7) 연구책임자 또는 참여 연구자가 본 연구 대상자로 부적합하다고 판단한 사례.
H. pylori 감염 여부는 혈청 항-H. pylori 항체 역가와 내시경 소견을 기반으로 판정하였다. 감염 상태의 판단이 어려운 경우에는 대변 항원 검사를 추가로 실시하였다. AIG 환자 중 H. pylori 감염 사례는 3건(2.4%)이었고, 대조군에서는 24건(18.6%)이었다(표 1).
Measurement of APCA titers
등록된 환자의 혈청은 아래에 설명된 기존의 형광항체법(FA)과 새로운 라텍스 응집법(LA)을 사용하여 APCA 역가를 평가하는 데 사용되었다.
LA method
H⁺,K⁺-ATPase는 α-소단위와 β-소단위로 구성되며, 대부분의 위벽세포항체는 β-소단위와 반응한다[5]. 따라서 인간 H⁺,K⁺-ATPase β-소단위의 세포외 도메인(아미노산 서열 64-291)의 N-말단 쪽에 His 태그를 삽입하여 발현 벡터를 제작하였다(Fig. 1).
Fig. 1. The schematic diagram of H+ , K+ -ATPase is shown, and the numbers indicate the amino acid number of the β-subunit.
시약 1 (R1)은 1.0% NaCl, 0.09% NaN3, 0.1% 우혈청알부민(Merck Millipore, USA-MA), 18% 공중합체 기반 응집 증강제(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japan)를 포함한 pH 7.0의 Good’s buffer였다. 분석에는 자동 생화학 분석기(JCA-BM9130, JEOL Ltd., Tokyo, Japan)가 사용되었다. 측정 과정에서는 45 μL의 R1과 1.5 μL의 혈청 샘플을 혼합하여 37°C에서 5분간 반응시킨 뒤, 15 μL의 라텍스 시약을 추가하고 다시 37°C에서 5분간 반응시켜 805 nm 파장에서의 흡광도 변화를 측정하였다.
FA method
FA 측정은 SRL 주식회사와 BML 주식회사에서 수행되었다. 분석에 사용된 컷오프 값은 해당 회사들이 제공한 10배 희석 기준이었다.
Statistics
모든 임상병리학적 특성은 연속형 자료의 비교를 위해 Wilcoxon 순위합 검정을 사용하여 분석하였다. P 값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 모든 통계 분석은 JMP 소프트웨어 버전 16 (SAS International Inc., Cary, NC, USA)을 사용하여 수행되었다.
Results
Antibody titers evaluated by FA and LA methods.
127명의 AIG 환자와 129명의 대조군 혈청 샘플에 대해 FA 방법과 LA 방법을 이용하여 항체 역가를 측정하였다. LA 방법에 대해 수신자 조작 특성(ROC) 분석을 수행하였다(Fig. 2).
Fig. 2. Receiver operating characteristic (ROC) analysis of latex agglutination (LA) method. Number in parentheses indicate area under the curve (AUC).
LA 방법에서 산출된 AUC는 0.942로, 매우 우수한 것으로 평가되었다[12]. LA 방법의 컷오프 값은 Youden 지수를 이용해 계산되었으며, 10 U/mL로 정의되었다. 두 검사 방법 모두 AIG 그룹의 혈청에서 대조군에 비해 유의하게 높은 항체 역가를 보였다(Fig. 3).
Fig. 3. Autoimmune gastritis (AIG) sera (n=127) and control sera (n=129) measured by latex agglutination (LA) and fluorescent antibody (FA) methods. P values were calculated by Wilcoxon’s rank-sum test. The center line of the box indicates the median of data; the bottom and top lines indicate the 25th and 75th quartiles. Lines extending from the box indicate 1.5× the quartile range from the top and bottom of the box.
Sensitivity and specificity of each method
각 방법의 통계 지표는 표 2에 요약되어 있다. 새로운 LA 방법의 민감도와 특이도는 각각 93.7%와 95.4%로 계산되었다. 반면, 기존의 FA 방법은 SRL 주식회사와 BML 주식회사가 제시한 컷오프 기준인 10배 희석 조건에서 분석하였을 때, 민감도는 99.2%, 특이도는 41.1%로 계산되었다. 전체 정확도는 LA 방법에서 94.5%였으며, 기존 FA 방법에서는 69.9%에 불과하였다.
Discussion
일본에서는 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 감염의 유병률이 현저히 감소함에 따라 상부 위장관 질환의 역학이 크게 변화하고 있다[13]. 최근 AIG(자가면역성 위염)는 소화기내과 분야에서 중요한 질환으로 인식되고 있으며, 위암 및 신경내분비종양의 고위험 요인일 뿐만 아니라 악성 빈혈, 신경계 질환 및 자가면역 다내분비증후군(autoimmune polyendocrine syndrome)과 같은 전신 질환과도 관련된 병리적 상태이다[14]. AIG는 일본에서 드물지 않기 때문에[15], 정확한 진단이 최근 임상 현장에서 매우 중요해지고 있다.
건강검진 등 대규모 검사에서 AIG를 진단하기 위해서는 혈청학적 선별검사가 필수적이다. 그러나 일본에서는 AIG를 객관적이고 재현성 있게 진단할 수 있는 우수한 검사법이 아직 없다. 유럽 헬리코박터 및 마이크로바이오타 연구 그룹(European Helicobacter and Microbiota Study Group)의 가이드라인은 AIG 진단을 위해 APCA를 포함한 혈청 마커 측정의 중요성을 강조하고 있다[16]. 비록 AIG에 대한 엄격한 진단 기준이 확립되어 있지는 않지만, 혈청 APCA 수치와 조직학적 소견은 진단의 중요한 근거로 간주된다[17,18].
위암 등 합병증의 유병률을 조사할 때는 H. pylori 감염 여부를 최대한 구분하는 것이 중요하다[19]. 그러나 AIG 진단 정확도를 조사하는 데 있어서 H. pylori 감염 사례가 포함된다고 해서 연구의 타당성이 손상되는 것은 아니다. 오히려 H. pylori 감염이 있는 경우에도 AIG를 진단할 수 있다는 점은 의미 있는 일이다[6].
또한, 혈청 가스트린은 AIG 진단에 중요한 검사 항목 중 하나이나[20], AIG를 포함한 체부 위축성 위염의 중증 사례에서는 높은 수치를 보이지 않을 수 있다[21]. 따라서 혈청 가스트린 수치는 일본의 진단 지침에는 포함되어 있지 않다. 가스트린 수치는 산분비 억제제 복용, 음식 섭취, 신장 기능 장애 등 다양한 요인의 영향을 받는다[20]. 실제로 본 연구의 AIG 환자에서도 혈청 가스트린 수치는 반드시 매우 높게 나타나지는 않았다(자료 미제시). 또 다른 중요한 문제는 일본과 유럽 간의 가스트린 측정법 차이로 인해[22], 혈청 가스트린 수치를 직접 비교하기 어려운 점이다.
이전에는 돼지 위에서 추출한 항원을 사용하여 APCA 측정 시스템을 개발하고 보고한 바 있다[5]. 이 측정법에서는 AIG 환자의 혈청 수치가 유의하게 높았지만, 배경 수치도 높아 AIG와 대조군을 구분하는 데에는 충분하지 않았다 (미발표 자료). 또한 항원으로 사용한 돼지의 양성자 펌프의 안정적인 공급이 어려웠던 점도 제한 사항이었다. 따라서 이번 연구의 첫 번째 과제는 안정적으로 공급 가능한 인간 유래 양성자 펌프 항원을 확보하는 것이었다. 우리는 인간 H+,K+-ATPase β-소단위체의 세포외 도메인에서 재조합 단백질을 생산하고, 이를 항원으로 사용한 측정 시스템의 유용성을 확인함으로써 이 문제를 해결했다. 이 재조합 항원을 사용함으로써 비특이적 반응을 최소화한 안정적인 공급이 가능한 LA 측정 키트를 구축할 수 있었다.
이번 연구 결과는 LA 시스템이 기존의 FA 방법보다 우수함을 보여주며, 본 측정법이 AIG 진단을 위한 새로운 검사 시스템임을 나타낸다. 혈청학적 검사법은 임상 현장에서 필수적이며, 특히 대규모 선별검사에서 유용하다. 선별검사에서는 진단의 특이도가 매우 중요하다는 점을 강조해야 한다. 본 연구에서는 새로운 LA 방법이 기존 FA 방법보다 뛰어난 진단 특이도를 가졌음을 입증했다(LA: 95.4% vs FA: 41.1%). 또한 높은 정확도(LA: 94.5% vs FA: 69.9%)는 AIG 진단에서 LA 방법의 유용성을 확인시켜준다.
하지만 해결해야 할 몇 가지 제한점이 있다. 본 연구는 후향적 연구로, AIG를 진단할 당시 이미 APCA가 측정되어 있어, 이 결과가 AIG 진단에 영향을 미쳤을 가능성이 있다. 또한 대조군 내에 조기 단계 AIG 환자가 포함되어 있었을 가능성도 있다. 조기 AIG는 조직 검사로만 진단되는 경우가 많으며[23,24], 모든 대조군에서 조직 검사가 이루어진 것은 아니다. 더불어, 정확도는 분석에 포함된 사례 수에 영향을 받기 때문에 이번 결과는 절대적인 수치가 아닌 상대적인 수치로 해석할 필요가 있다. 이러한 제한점은 향후 대규모 전향적 연구를 통해 극복할 수 있을 것이다.
결론적으로, 우리는 AIG 진단에 유용한 새로운 APCA 측정 시스템을 개발하였다. 본 측정 시스템이 의료 현장에 도입됨으로써 AIG에 대한 추가 연구와 임상 진단이 더욱 활성화될 것으로 기대된다.
<Abstract >
Introduction: Recent findings revealed that autoimmune gastritis (AIG) is not rare in Japan. Therefore, the accurate diagnosis of AIG is essential in upper gastrointestinal practice. Diagnostic criteria for AIG were established in 2023; however, the conventional fluorescent antibody (FA) method for anti-parietal cell antibody titer (APCA) measurements has low accuracy and is clinically problematic.
Methods: We developed a latex agglutination (LA) method using a new human-derived antigen. Samples subjected to measurements were sera from AIG cases (127 cases, 49 males, average age 65.9 years) and control cases (129 cases, 81 males, average age 66.1 years) provided by the main facility and three affiliated facilities in Japan. APCA in whole serum was measured using the FA and LA methods.
Results: The diagnostic ability of AIG using the FA method was as follows: sensitivity of 99.2%, specificity of 41.1%, and an overall agreement rate of 69.9%, with low specificity previously being reported. On the other hand, the new LA method had good diagnostic performance with sensitivity of 93.7%, specificity of 95.4%, and an overall agreement rate of 94.5%.
Conclusion: We developed a new APCA measurement system that will contribute to the accurate diagnosis of AIG. The use of this measurement system in clinical practice will facilitate the diagnosis and treatment of AIG.