Tokunaga K, Miyoshi S, Hojo F, Yonezawa H, Ida Y, Oka K, Takahashi M, Kamiya S, Miyoshi J, Hisamatsu T, Osaki T.
Sci Rep. 2025 Jul 29;15(1):27658. doi: 10.1038/s41598-025-12211-3.
만성 위염은 A형과 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 감염에 의해 유발되는 B형으로 분류된다 [1]. A형 위염은 위의 체부에 해당하는 기저선(fundus gland) 영역에서 위축성 변화가 나타나는 것이 특징이며, 장기 특이적 면역질환인 자가면역성 위염(AIG)으로도 알려져 있다. 이는 위의 벽세포(parietal cell)가 파괴되어 내인자(intrinsic factor)의 소실과 위산 분비 감소로 이어지는 질환이다. 반면, B형 위염은 H. pylori 감염에 의해 유발되며, 위축성 변화가 유문부에서 체부까지 확장되는 것이 특징이다.
H. pylori 감염률이 높은 일본에서는 대부분의 위 점막 위축이 H. pylori 감염에 의해 발생한다. 최근 들어 H. pylori 감염률의 감소와 H. pylori 표적 치료제의 보급으로 인해 과거에는 드물게 여겨졌던 AIG가 주목받고 있다. AIG가 큰 주목을 받지 못한 또 다른 이유는 과거에 AIG가 북유럽의 고령 여성에게 흔한 질환으로 여겨졌기 때문이다 [1]. 하지만 Notsu 등 [2]의 최근 연구에 따르면 일본에서 내시경으로 검진한 6,793건 중 AIG의 빈도는 전체적으로 0.49%(여성 0.65%, 남성 0.40%)였으며, Terao 등 [3]의 다기관 연구에서는 전체 8,716건 중 AIG 유병률이 0.49%(43건)로 보고되었다. 이들 연구는 AIG가 일본에서도 흔하게 나타나는 질환임을 시사하며, 북유럽에 국한되지 않음을 보여준다. 반면, 해외 연구에서는 AIG의 유병률이 2.3%에서 10% 이상까지 보고되어 있으며 [4], 진단법의 발전에 따라 그 비율은 더 증가할 수 있다 [5].
H. pylori 제균 치료가 성공적으로 이루어지면, H. pylori에 대한 염증 반응이 사라지고, 위축된 점막 [6] 및 벽세포 기능이 개선되며, 감소된 위산 분비가 회복된다 [7]. 그러나 AIG는 위 벽세포에 대한 자가항체에 의해 벽세포가 파괴되며, 이로 인해 위산(염산 및 내인자) 분비가 감소하게 되어 [4], 제균 치료로는 큰 호전을 기대하기 어렵다. 이러한 자가항체가 생성되는 원인과 그 구체적인 기전은 아직 명확히 밝혀지지 않았으며, 따라서 AIG에 대한 치료법도 확립되지 않았고, 위축이나 위산 분비의 회복도 기대하기 어렵다. 따라서 AIG의 병태생리를 정밀하게 분석하여 예후, 예측, 치료에 유용한 정보를 얻는 것이 중요하다.
본 연구에서는 AIG 환자의 위장 미생물군 구성에 주목하였으며, AIG 병태생리에 관여하는 위장 박테리아, 이들의 발암과의 관련성, 질병 개선에 대한 가능성을 규명하는 것을 목표로 하였다.
여러 연구에서 H. pylori 감염이 자가면역 질환의 병태생리에 관여할 수 있다고 보고되었다 [8]. H. pylori에 대한 항체가 AIG에서 자가항체처럼 작용할 수 있다는 가능성도 제기되어 왔다. 예를 들어, H. pylori의 urease β 소단위는 위 벽세포의 ATPase β 소단위와 높은 상동성을 가지므로, 자가면역 반응을 유발할 수 있다 [9]. 따라서 AIG 환자와 H. pylori 감염 환자의 위장 미생물군을 비교하는 것은 중요하다. 그러나 현재 H. pylori에 감염된 환자는 위장 미생물군에서 H. pylori의 비율이 매우 높기 때문에, 비감염 환자와의 비교가 어렵다. 따라서 본 연구에서는 H. pylori 감염 이력이 있으나 제균 치료 후 현재는 감염되지 않은 위축성 위염 환자를 포함시켰다.
그러나 B형 위염과 AIG는 임상적으로 유사하기 때문에, 일본에서는 AIG 환자에게 H. pylori 제균 치료가 잘못 시행되는 경우가 있다. 실제로 일부 AIG 환자는 과거 H. pylori에 감염된 적이 있을 수 있다. 따라서 본 연구에서는 현재 감염 여부와 관계없이 1년 이상 전에 제균 치료를 받은 AIG 환자와, 과거 H. pylori에 감염되었고 제균 치료를 받은 만성 위축성 위염(B형) 환자를 비교 대상으로 삼았다.
두 환자군의 위장 미생물군을 비교 분석하여, H. pylori 제균 치료 후 위장 미생물군 구성의 차이를 규명하고자 하였다. 본 연구의 목적은 두 군 사이의 위 미세생태계 차이를 밝히고, H. pylori 음성 위암의 위험 인자가 될 수 있는 박테리아의 존재 여부를 조사하는 데 있다.
Results
Characteristics of patients with AIG
우리는 2018년 11월부터 2024년 11월 30일까지 교린대학병원(Kyorin University Hospital)을 방문하여 내시경 검사를 받은 위축성 위염 환자들을 대상으로 연구를 진행하였다. AIG(자가면역성 위염)로 진단된 환자 25명과, 과거 H. pylori 감염력이 있으며 제균 치료를 받고 1년 이상 경과한 위축성 위염 환자 26명으로부터 위 생검 검체를 수집하였다. 모든 환자는 연구 참여에 앞서 사전 동의서를 작성하였다.
16S rRNA 유전자 증폭 시퀀싱 분석이나 기타 진단 검사에서 H. pylori 양성으로 확인된 검체와 PCR 증폭이 충분하지 않았던 두 개의 검체는 제외되었다. 최종적으로 AIG 환자 20명과 위축성 위염(대조군) 환자 19명을 평가하였다(Fig. 1).
Fig. 1. Summary of the characteristics of patients included in this study.
AIG 환자들의 특징적인 소견은 표 1과 표 2에 제시되어 있다. 모든 AIG 환자는 혈청에서 벽세포 항체 또는 내인자 항체가 검출되었으며, 내시경 검사상 20명 중 17명은 위 체부(corpus)에 국한된 고도 위축 소견을 보였다. AIG 환자에서는 체부 우세 위축 소견이 85.7%로, 비-AIG 환자(0%)에 비해 유의하게 높은 비율을 보였다(P < 0.001). 특히, 이들 환자에서는 혈청 가스트린 수치가 높게 나타났다. 또한 AIG 환자 20명 중 1명(사례 A15)에서는 고농도의 항-H. pylori IgG가, 7명(사례 A2, A9, A12, A13, A16, A19, A20)에서는 저농도의 항-H. pylori IgG가 각각 검출되었다(표 2). AIG 및 위축성 위염 환자 모두에서, 내시경 소견과 16S 메타유전체 증폭 시퀀싱을 기반으로 검체 수집 시점의 H. pylori 감염은 음성으로 평가되었다.
Table 1. Characterization of patients with autoimmune gastritis in this study. *N/A:Not tested.
Table 2. Comparison between patients with autoimmune gastritis (AIG) and those with atrophic gastritis due to H. pylori-infection in this study. *Atrophic grade was defined as follows, O: open type, C: closed type , O-P:
Comparison of characteristics between patients with AIG and those with atrophic gastritis
AIG 환자군, 위축성 위염 대조군, 그리고 각 환자에게 시행된 마지막 제균 치료 요법에 대한 배경 정보는 표 2에 제시되어 있다. AIG 환자의 평균 연령은 67.8 ± 7.2세로, 대조군의 평균 연령인 60.8 ± 9.15세와 유의한 차이는 없었다. 성비는 AIG 환자군에서 남성:여성이 16:4였으며, 대조군에서는 11:8이었다. AIG 환자 20명 중 19명은 체부 우세 위축 여부와 관계없이 위축 정도가 O-3로 진단되었고, 단 한 명(사례 A2)만이 O-2로 진단되었다. 대조군에서는 10명이 폐쇄형 위축성 위염(C-2 또는 C-3)으로 진단되었다.
제균 치료를 받은 환자에 대해서는 치료 시작 시점부터 검체 채취 시점까지의 기간을 계산하였다. 두 군 간에는 유의한 차이가 있었으며, AIG군은 평균 1년, 대조군은 3.5 ± 1.7년이었다(P < 0.01). 요소호기검사(UBT)의 평균 수치는 AIG군에서 14.1 ± 26.4‰로, 대조군의 0.9 ± 0.7‰보다 유의하게 높았다(P < 0.01). 카이제곱 검정 결과, 제균 치료를 받은 횟수는 AIG군이 대조군보다 유의하게 많았다.
Gastric microbiota in patients with AIG and those with atrophic gastritis
AIG 환자의 위 체부(corpus)와 유문부(antrum)의 위장 미생물군은 주로 Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidota, Fusobacteria, Actinobacteria의 다섯 문(phylum)으로 구성되어 있었다(Fig. 2A). AIG 환자의 위 유문부 및 체부에서 Bacteroidota의 상대적 풍부도(abundance)는 대조군의 위 체부 및 유문부보다 유의하게 낮았다(P < 0.05 및 P < 0.01). 반면, AIG 환자의 위 체부에서 Proteobacteria의 상대적 풍부도는 대조군의 위 체부 및 유문부보다 유의하게 높았으며(P < 0.01), AIG 환자의 위 유문부에서도 대조군 유문부보다 유의하게 높은 것으로 나타났다(P < 0.05).
Firmicutes 문은 주로 Streptococcus 속(genus)으로 구성되어 있었으며, AIG 환자에서 Streptococcus 속의 풍부도는 대조군보다 위 체부와 유문부 모두에서 유의하게 높았다(P < 0.05). Bacteroidetes 문은 Prevotella, Prevotella 7, Porphyromonas, Alloprevotella, Capnocytophaga 속으로 구성되어 있었다(Fig. 2B). 이 중 AIG 환자의 위 체부에서 Prevotella 속의 풍부도는 대조군의 위 유문부에 비해 유의하게 낮았다(P < 0.05).
Fig. 2. The microbiota composition in the gastric corpus or gastric antrum of patients with autoimmune gastritis and atrophic gastritis. The relative abundance of bacterial phyla (A) and genera (B).
* 알파다양성: 미생물 무리 자체의 다양성 (얼마나 많은 수의 미생물이 있는지 (richness)와 얼마나 고르게 분포되어 있는지 (evenness))
* 베타다양성: 미생물 무리 구성이 대조군의 미생물 무리 구성과 어떻게 다른가에 대한 내용 (상대적인 값)
Alpha diversity of gastric microbiota in patients with AIG and those with atrophic gastritis
위장 미생물군의 알파 다양성(alpha diversity)과 관련하여, AIG 환자의 위 체부(corpus)와 유문부(antrum) 모두에서 Shannon 지수, Pielou의 균등도(evenness) 지수, 그리고 Simpson 지수가 대조군에 비해 유의하게 낮았다(Fig. 3A–C). 반면, Chao-1 지수는 대조군과 AIG 군 간에 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 3D).
Fig. 3. Alpha diversity according to gastric bacterial compositions in patients with autoimmune gastritis and those with chronic gastritis after Helicobacter pylori eradication. Chao-1 (A), Shannon (B), Pielou’s evenness (C), and Simpson (D) indices are represented in samples from each group of patients. *Statistically significant (**: P < 0.01, *: P < 0.05).
Beta diversity of gastric microbiota in patients with AIG and those with atrophic gastritis
우리는 비가중 및 가중 UniFrac 계통 거리(unweighted and weighted UniFrac phylogenetic distance) 지표를 사용하여 베타 다양성(beta diversity)을 계산하고, 주좌표 분석(PCoA) 그래프로 시각화하였다. 그 결과, AIG 환자의 위 체부(Fig. 4A, B)와 유문부(Fig. 5A, B)의 미생물군 구성은 만성 위염 환자와 유의하게 다르게 나타났으며, 이는 가중 UniFrac 거리 기반 PERMANOVA 분석을 통해 확인되었다(Fig. 4B; q = 0.00062, Fig. 5B; q = 0.00004). 반면, 비가중 UniFrac 거리에서는 AIG와 위축성 위염 환자 간에 위 체부 및 유문부 모두에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다(Fig. 4A 및 Fig. 5A).
Fig. 4. Principal coordinate analysis (PCoA) plots of unweighted (A) and weighted UniFrac distances (B) in which gastric corpus samples were colored according to clinical outcome (blue: AIG, orange: atrophic gastritis). The percentage of diversity captured by each coordinate is shown. PERMANOVA, analysis of similarity.
Fig. 5. Principal coordinate analysis (PCoA) plots of (A) unweighted and (B) weighted UniFrac distances in which gastric antrum samples were colored according to clinical outcome (blue: AIG, orange: atrophic gastritis). The percentage of diversity captured by each coordinate is shown. PERMANOVA, analysis of similarity.
Association of specific microbiota taxa with AIG and atrophic gastritis according to Microbiome Multivariable Association with Linear Models 2 (MaAsLin 2)
두 그룹 간 임상 진단의 차이에 기여하는 주요 균주(taxa)를 확인하기 위해, 우리는 위 체부(corpus)와 유문부(antrum)의 미생물군에 대해 Microbiome Multivariable Association with Linear Models 2 분석을 수행하였다. 그 결과, AIG 환자의 위 체부에서는 Haemophilus, Streptococcus, Bergeyella 속이 검출되었으며, 위축성 위염 대조군의 위 체부에서는 Cutibacterium, Centipeda, Candidatus_Saccharimonas 속이 유의하게 더 높은 수준으로 존재함이 확인되었다(Supplementary Fig. 1).
Supplement Fig. 1. Comparative study for the abundance of genera in gastric corpus microbiota between the AIG patients and control patients with atrophic gastritis using MaAsLin 2 as a linear model. The genera Cutibacterium, Centipeda, and Candidatus_Saccharimonas were shown significantly higher abundance in control patients, and the genera Bergeyella and Haemophilus were significantly higher abundance in the AIG patients.
또한 AIG 환자의 위 유문부에서는 Streptococcus 속이 검출되었고, 위축성 위염 대조군의 위 체부에서는 Selenomonas 및 Candidatus_Saccharimonas 속이 유의하게 많이 존재하는 것으로 나타났다(Supplementary Fig. 2).
Supplement Fig. 2. FDR: 1.282e−01 Coefficient: 2.56e+00 Value: GI 0.075 0.050 0.025 0.000 diagnosis AIG (n=20) GI (n=19) Comparative study for the abundance of genera in gastric antrum microbiota between the AIG patients and control patients with atrophic gastritis using MaAsLin 2 as a linear model. The genus Streptococcus was shown in significantly higher abundance in AIG patients, and the genera Selenomonas and Candidatus Saccharimonas were shown in significantly higher abundance in control patients.
제균 치료 이후 경과 시간(년 단위)을 독립 변수로 하여 MaAsLin 2 선형 모델을 이용해 분석한 결과, 여러 유의한 시간적 상관관계를 확인하였다. Micrococcales 목(order)과 Acidiphilium 및 MN_122.2a 속(genus)은 시간 경과에 따라 유의한 양의 상관관계를 보였으며(Fig. 6A 및 B), 반면 Granulicatella 속은 동일한 기간 동안 유의한 음의 상관관계를 나타냈다.
Fig. 6. MaAsLin2 significant results and associations between facter (year of age), and gastric microbiota composition of gastric corpus (A), and antrum (B). Diagnosys means AIG(blue) vs control with atrophic gastritis (red) patients.
Discussion
정상 위의 환경은 산성이며, 일반적으로 세균 성장에 불리한 것으로 간주된다. 그러나 분자 생물학적 분석을 활용한 여러 연구에 따르면, 산성의 위 환경에서도 세균이 정착할 수 있음이 밝혀졌다 [10]. 여러 연구들 [11,12]에 따르면, 건강한 개인의 위장 미생물군은 주로 Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Fusobacteria의 다섯 가지 문(phylum)으로 구성된다. AIG에서는 위 벽세포의 산 분비 기능이 소실되기 때문에 위 내 환경이 저산성(hypochlorhydria) 상태가 된다. 이러한 독특한 위 내 환경으로 인해, AIG 환자의 위장 미생물군 구성은 건강한 정상 위와 다를 것으로 예상되었다. 그러나 본 연구에서 AIG 환자의 위 미생물 분석 결과, 정상 위에서 우세한 다섯 문이 AIG 환자에서도 동일하게 우세하게 나타났다.
세포학 브러시(cytology brush) 검체를 이용한 한 인구 기반 연구에서는 위장 증상이 있는 환자와 없는 환자의 위장 미생물군 구성을 보고하였다 [13]. 위장 증상이 없는 환자의 위장에서는 Firmicutes(42%), Bacteroidetes(24%), Proteobacteria(17%), Actinobacteria(7%), Fusobacteria(6%)가 존재하였으며, 이는 본 연구 결과와 일치하였다. 이 결과는 제균 치료를 받은 대조군의 위장 미생물군 구성이, 위염이 잔존해 있음에도 불구하고 건강한 사람의 미생물군 구성과 유사하다는 것을 시사한다.
한편, AIG 환자의 위장 미생물군에서 Bacteroidota의 풍부도는 위축성 위염 환자보다 유의하게 낮았고, 위 체부에서 Proteobacteria의 풍부도는 위축성 위염 환자의 위 체부 및 유문부보다 유의하게 높았다. 각 군에서 Proteobacteria와 Bacteroidetes의 상대 비율(P/B ratio)을 계산한 결과, AIG 환자에서 평균 P/B 비율이 대조군보다 유의하게 높았다(데이터 미제시). 이는 AIG 환자가 제균 치료 후에도 정상적인 위장 미생물군을 재구성하지 못할 수 있으며, 이는 정상적인 산 분비 회복의 실패 때문일 수 있음을 시사한다.
여러 연구 [13–15]에 따르면, H. pylori 감염은 위장 미생물군의 알파 다양성을 감소시키며, 이는 H. pylori가 다른 균주보다 우세해지는 결과와 관련된다. H. pylori는 다른 위장 균주들과 상호작용하며, 알파 다양성과 음의 상관관계를 가진다 [16]. 따라서 H. pylori 제균에 성공하면 OTU(operational taxonomic units) 수와 Chao-1 지수가 증가하게 된다. 본 연구에서는 H. pylori 비감염 상태인 AIG 및 위축성 위염 환자의 위 미생물군 알파 다양성이 높을 것으로 예상하였으나, 그 수준이 건강한 사람과 같은지는 불분명하였다. 본 연구에서 두 군의 OTU 중앙값은 100–200 범위였던 반면, 건강한 사람의 위 미생물군에서는 400개 이상의 OTU가 보고되었다 [16]. 따라서 알파 다양성 측면에서 AIG 및 대조군 모두는 건강한 사람과는 다른 상태에 있었으며, 이는 이전의 제균 치료에 기인했을 가능성이 있다.
Yang 등 [17]의 연구에서는 제균 치료를 받은 환자들을 성공군과 실패군으로 나누어 분석하였다. H. pylori 제균에 성공한 환자들은 알파 다양성이 더 높았으나, 베타 다양성에서는 차이를 보이지 않았다. 위축성 위염의 경우 H. pylori 제균 이후에도 위산 분비의 완전한 회복은 어려운 것으로 알려져 있다.
또한, H. pylori 유도 위축성 위염, AIG, 그리고 PPI(프로톤 펌프 억제제) 복용자 간의 위장 미생물군 비교 연구도 보고되었다 [18]. AIG 환자와 PPI 복용자의 위 생검 검체는 H. pylori 유도 위축성 위염 환자보다 더 높은 세균 다양성을 나타냈다.
이번 AIG와 위축성 위염 환자 간의 비교 연구에서는 AIG 환자의 위장 미생물군에서 Shannon 지수, Pielou의 균등도, Simpson 지수가 모두 대조군보다 유의하게 낮았다. 반면, Chao-1 지수는 두 군 간 유의한 차이가 없었다. 이러한 특징은 대조군에서는 관찰되지 않았으며, AIG 환자에서의 공복 혈청 가스트린 농도 상승과 관련이 있을 수 있다(표 1 참조). Shannon 및 Simpson 지수의 감소는 미생물 군집의 다양성 저하를 나타내며, Pielou의 균등도 감소는 균주 간 분포가 고르지 않음을 의미한다. 따라서 AIG와 관련된 특정 균주 특성이 위장 미생물군의 구성에 강한 영향을 미쳐 알파 다양성에 영향을 미치는 것으로 보인다.
또한, 위 유문부의 미생물군에서 Sphingobium 속의 풍부도와 혈청 가스트린 농도 간에 유의한 상관관계가 확인되었으며(p = 0.000212, q = 0.031637), 위 체부에서는 이러한 상관관계가 나타나지 않았다. H. pylori에 감염되지 않은 피험자에서는 나이에 따라 Proteobacteria, 특히 Enhydrobacter, Comamonadaceae, Sphingobium 속이 증가한다는 보고도 있었다 [19]. Sphingobium 속이 위에서 어떤 역할을 하며 가스트린과 어떤 관계가 있는지는 아직 밝혀지지 않았으며, 추가 연구가 필요하다.
과거 AIG 환자와 비-AIG 환자의 위장 미생물군을 비교한 Tsuboi 등 [20]의 연구에서는, AIG 환자에서 Streptococcus, Selenomonas, Granulicatella, Bacillus spp. 등의 속이 대조군보다 유의하게 더 많이 존재함을 보고하였다. 이 연구에서도 AIG 환자 14명 중 10명(71.43%)이 제균 치료를 받은 이력이 있어, 본 연구와 유사한 비교 구조를 보인다. 본 연구에서도 AIG 환자의 위 유문부에서 Streptococcus 및 Granulicatella 속의 풍부도가 높았고, 위 체부에서도 Streptococcus 속이 증가해 있었다. Streptococcus 및 Granulicatella 속은 위축 및 장상피화생의 발생 및 지속과도 연관되어 있다고 보고되었다 [21]. Granulicatella는 뿌리관 감염과 관련된 그람 양성 조건혐기성 세균이며 [22], Streptococcaceae의 상대적 풍부도는 PPI 복용 환자에서 복용하지 않은 환자보다 유의하게 높았고, Streptococcus 속의 풍부도는 H. pylori 감염 여부와 무관하게 PPI 복용에 따라 증가하였다 [23]. 이는 H. pylori가 위에 없고 위산 분비가 저하된 상태가 Streptococcus 속 증가에 기여할 수 있음을 시사한다.
H. pylori 감염과 위암 발생률 간의 관계는 잘 알려져 있으나, AIG와 위암 발생률 간의 관계는 아직 불분명하다. H. pylori 제균 후 3년 이상 장기간 PPI를 복용한 경우, 위산 분비 저하로 인한 장기적인 dysbiosis가 위암 발생에 기여하여 비심부(noncardiac) 위암의 발생률이 2.4배 증가했다는 보고도 있다 [24]. 위암 환자의 위장 미생물군은 장내 공생균 및 구강 유래 Streptococcus, Prevotella 등의 속이 증가한 특징을 보였으며 [25,26], 메타분석에서는 위암 환자에서 Fusobacterium, Parvimonas, Veillonella, Prevotella, Peptostreptococcus 등의 기회감염균이 증가하고 Bifidobacterium, Bacillus, Blautia 등의 공생균이 감소했다는 결과가 있었다 [27]. 그러나 본 연구에서는 AIG 환자에서 Streptococcus 속이, 위축성 위염 대조군에서는 Prevotella 속이 더 풍부하게 나타났다. 동물실험에서는 Streptococcus anginosus가 발암을 유도한다는 보고도 있었으며 [28], 향후 연구에서는 이러한 균의 보유 정도를 개별적으로 확인할 필요가 있다.
PPI를 대체하여 상부 위장관 질환 치료에 사용되고 있는 칼륨 경쟁성 산 차단제(PCABs)는 H. pylori 제균 환자에서 위암 위험을 증가시키며, 복용 기간 및 용량에 따라 반응 효과가 관찰된다 [29]. 본 연구에서는 PPI 및 PCAB 장기 복용자는 제외되었으나, 향후 연구에서는 이들을 포함한 비교 분석이 필요하다.
최근 Rugge 등 [30]은 일반 인구와 비교했을 때, 위 체부에 국한된 염증 및 위축 소견이 위암 발생 위험을 증가시키지 않는다고 보고하였다. 그들은 장기 추적 병리학적 연구를 통해, H. pylori 음성 AIG 환자에서 자연경과, 조직학적 표현형, 암 발생 위험을 분석하였다. 총 10,541 인년의 누적 추적 기간 동안 위암이나 기타 암의 위험 증가는 없었으며, 단지 갑상선암의 위험이 경계선상 유의성(marginal significance)을 보였다. 해당 연구에 대한 견해 차이가 있긴 하나 [31], H. pylori가 존재하지 않고 위산 분비가 저하된 환경에서는 위암과 관련된 박테리아에 의해 위암 위험이 이론적으로 증가할 수 있다는 우려가 있다.
위 벽세포의 프로톤 펌프는 항벽세포 자가항체의 표적이 되며, 항내인자 자가항체도 함께 나타난다. 이러한 자가항체 생성 기전에는 H. pylori 감염에 의해 손상된 벽세포 항원에 대한 T세포 반응이 포함되며 [32], 세균과 숙주 분자 간의 구조적 유사성에 의해 자가항체가 유도되는 병태기전은 여러 자가면역질환에서 관찰된다. 본 연구에서는 AIG 환자가 H. pylori에 감염된 병력이 있는지를 명확히 밝히지는 않았으나, 15명의 환자 중 6명에게서 항-H. pylori IgG 항체가 검출되었고, 이 중 2명은 항체 역가가 특히 높았다(표 2 참조). AIG 환자는 소장에서 비타민 B12를 정상적으로 흡수하지 못하기 때문에 악성빈혈 및 말초신경병증의 위험이 증가한다. 따라서 AIG의 병태생리를 정밀하게 분석하는 것은 예후 예측과 치료 전략 수립에 있어 매우 중요하다.
본 연구에서는 각 환자에게서 위 체부와 유문부에서 각각 하나씩 총 두 개의 위 생검 조직을 채취하였다. AIG 환자에서는 위축이 반대 양상(inverse atrophy)을 보이는 특성이 있어, 위 부위에 따라 위장 미생물군 구성이 다를 수 있다고 가정하였다. 그러나 위 부위에 따른 미생물군 구성의 뚜렷한 차이는 관찰되지 않았다. 위 체부와 유문부의 위장 미생물군 간 베타 다양성을 비교하기 위해 weighted 및 unweighted UniFrac 거리를 사용한 PERMANOVA 분석 결과, 유의한 차이는 없었다. 이는 AIG 환자에서 위축 정도가 위 전체로 퍼져 있었을 가능성을 시사한다.
본 연구에는 몇 가지 한계점이 있다. 첫째, AIG 환자의 표본 수가 적었다. 둘째, 위축성 위염 대조군에서 제균 치료 후 경과 기간이 AIG 환자보다 유의하게 길었다. 셋째, AIG 환자의 위축 정도가 대조군보다 더 심했을 가능성이 있다. 이러한 요소들은 위장 미생물군 구성에 영향을 미쳤을 수 있으며, 향후 더 많은 사례를 포함한 연구가 필요하다.
결론적으로, 제균 치료 이후 AIG 환자의 위장 미생물군 구성은 만성 위염 환자와 유의하게 달랐으며, Shannon 지수, Pielou의 균등도, Simpson 지수 등 알파 다양성이 감소하였다. AIG 환자의 위장 미생물군은 Streptococcus 속의 풍부도가 증가하고 Prevotella 속의 풍부도는 감소한 특징을 보였다.
Materials and methods
Participants
2018년 11월 28일부터 2021년 7월 30일까지 교린대학병원(Kyorin University Hospital)에서 내시경을 위해 내원한 자가면역성 위염(AIG) 환자와 위축성 위염을 가진 대조군 환자들이 본 연구에 등록되었습니다. AIG는 내시경 소견 및 혈청학적으로 진단되었습니다[5]. 간단히 말해, 혈청에서 항위벽세포 항체 또는 항내인자 항체, 또는 두 항체 모두가 검출된 경우 AIG로 진단하였습니다. 대조군은 교린대학병원에서 H. pylori 감염으로 진단받고 1차 또는 2차 제균 치료를 받은 후 현재 H. pylori 음성 상태인 환자들이었습니다(그림 1 참조).
1차 제균 요법은 클라리트로마이신(CLR) 400mg 1일 2회, 아목시실린(AMX) 750mg 1일 2회, 그리고 PPI 또는 보노프라잔(P-CAB)을 7일간 투여하는 방식이었습니다. 1차 요법으로 H. pylori 제균에 실패한 경우, 2차 요법으로 PPI 또는 P-CAB, 메트로니다졸(MNZ) 250mg 1일 2회, AMX 750mg 1일 2회를 7일간 투여하였습니다. 1차 및 2차 요법으로도 제균에 실패한 환자에게는 고용량 AMX와 P-CAB를 14일간 투여하거나, 시타플록사신, AMX, P-CAB를 7일간 투여하는 3차 요법을 시행하였습니다.
13C-요소호기검사(13C-UBT)를 통해 제균 성공 여부를 확인하였습니다. 대조군 위축성 위염 환자들은 과거 H. pylori에 감염되었으나, 만성 위염에 대한 제균 치료를 받았고, 본 연구 당시에는 H. pylori에 감염되지 않은 상태였습니다.
이 연구는 헬싱키 선언(Declaration of Helsinki) 및 인간 대상 연구에 대한 윤리심사 절차를 준수하여 수행되었으며, 도쿄 교린대학교 윤리위원회(승인번호 624-04)의 승인을 받았습니다.
Biopsy specimens and DNA extraction
위 미생물군 분석을 위해 위체부(A)와 전정부(B)에서 내시경 시 위 생검 조직을 채취하였습니다. 신선한 검체는 DNA/RNA Shield 용액(Zymo Research, Irvine, CA, USA)에 넣어 4 °C에서 사용 전까지 보관하였습니다. 조직 샘플은 10,000 × g로 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였습니다. 전체 DNA는 제조사 지침에 따라 QIAamp Power Fecal Pro DNA Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 추출하였습니다. PCR 증폭 효율을 향상시키기 위해, 충분히 증폭되지 않은 경우에는 추출된 DNA에서 숙주 DNA를 제거하였습니다. 이 DNA 제거는 NEBNext® Microbiome DNA Enrichment Kit(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)를 제조사 지침에 따라 수행하였습니다.
16S rRNA gene amplicon sequencing analysis
위 생검 조직에서 추출된 총 DNA(< 12.5 ng)는 16S rRNA의 V3–V4 영역을 표적하여 증폭하였습니다. 증폭에는 포워드 프라이머(5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3′)와 리버스 프라이머(5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)가 사용되었으며, 프라이머에는 태그(tag) 영역이 포함되어 있었습니다. 1차 PCR 반응은 Platinum II Hot-Start PCR Master Mix(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA, USA)를 사용하여, 95 °C에서 3분간 초기 변성과 이어서 95 °C에서 30초, 55 °C에서 30초, 72 °C에서 30초의 조건으로 30–35회 반복한 후, 최종적으로 72 °C에서 5분간 반응시켜 수행하였습니다.
생성된 증폭산물은 제조사 지침에 따라 Nextera XT Index Kit(Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)를 이용하여 이중 인덱스(dual indices) 및 Illumina 시퀀싱 어댑터를 결합시켰습니다. 증폭산물의 시퀀싱은 Illumina MiSeq 시스템(Illumina)을 사용하여 수행하였습니다.
획득된 시퀀스 데이터는 Kraken2 소프트웨어 [33]를 이용하여 인간 참조 유전체(GRCh38)에 정렬하여 숙주 유래 시퀀스를 제거하였고, 남은 시퀀스는 QIIME2 (2019년 10월 버전) 파이프라인 [34]을 통해 분석하였습니다. 숙주가 아닌 paired-end 시퀀스는 DADA2 플러그인을 사용하여 품질 필터링, 노이즈 제거, 병합 및 키메라 제거 과정을 거쳤습니다. DADA2 [35]를 통해 얻은 amplicon sequence variants(ASVs)에 대해 SILVA 데이터베이스 v138.1 [36]을 기반으로 feature-classifier-classify sklearn 플러그인을 사용하여 분류학적 정보를 부여하였습니다.
각 샘플의 마이크로바이옴의 알파 다양성은 Chao-1, Pielou’s evenness, Shannon, Simpson 지수를 사용하여 평가하였습니다.
Statistical analysis
AIG군과 대조군 간의 차이의 유의성은 Wilcoxon 순위합 검정(Wilcoxon rank-sum test)을 사용하여 평가하였습니다. 군 간의 베타 다양성 차이는 PERMANOVA(permutational multivariate analysis of variance)를 이용하여 비교하였습니다. 또한 AIG 환자와 대조군 간의 미생물 바이오마커를 확인하기 위해 MaAsLin2(Microbiome Multivariable Associations with Linear Models) 분석도 수행하였습니다 [37].
<Abstract>
Fundamental treatments for autoimmune gastritis (AIG) have not yet been established; thus, analyzing AIG pathogenesis in detail to obtain useful information for prognosis prediction and treatment is crucial. This study explored bacteria involved in AIG pathogenesis by focusing on the gastric microbiota composition. Gastric biopsy tissues were collected endoscopically from the gastric corpus and antrum of patients with AIG and chronic gastritis. Total DNA was extracted from gastric biopsy specimens and used for 16S rRNA gene amplicon sequencing analysis. Principal coordinate analysis of diversity using the weighted UniFrac distance revealed that following Helicobacter pylori eradication, the gastric bacterial composition of patients with AIG differed significantly from that of patients with chronic gastritis, exhibiting decreased Shannon index, Pielou's evenness, and Simpson index of alpha diversity. The gastric microbiota of patients with AIG was characterized by an increased abundance of the genus Streptococcus and a reduced abundance of the genus Prevotella compared with that of patients with chronic gastritis.
Keywords: Helicobacter pylori; Autoimmune gastritis; Chronic gastritis; Genus Prevotella; Genus Streptococcus; Microbiota.
자가면역성 위염(AIG)에 대한 근본적인 치료법은 아직 확립되어 있지 않으므로, 예후 예측 및 치료에 유용한 정보를 얻기 위해 AIG의 병태생리를 면밀히 분석하는 것이 중요하다. 본 연구는 AIG 병태생리에 관여하는 균주를 규명하기 위해 위장 미생물군의 구성에 초점을 맞추었다. AIG 및 만성 위염 환자의 위 체부(corpus)와 유문부(antrum)에서 내시경을 통해 위 생검 조직을 채취하였고, 총 DNA를 추출하여 16S rRNA 유전자 증폭 시퀀싱 분석을 수행하였다.
가중 UniFrac 거리 기반의 다양성 주좌표 분석(principal coordinate analysis) 결과, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 제균 치료 이후 AIG 환자의 위장 미생물 조성은 만성 위염 환자와 유의하게 다름을 보였으며, AIG 환자군에서 Shannon 지수, Pielou의 균등도 지수, Simpson 지수 등 알파 다양성이 감소한 것이 확인되었다. 또한 AIG 환자의 위장 미생물군은 만성 위염 환자에 비해 Streptococcus 속의 풍부도는 증가하고, Prevotella 속의 풍부도는 감소한 것이 특징적으로 나타났다.
Tokunaga K, Miyoshi S, Hojo F, Yonezawa H, Ida Y, Oka K, Takahashi M, Kamiya S, Miyoshi J, Hisamatsu T, Osaki T.
Sci Rep. 2025 Jul 29;15(1):27658. doi: 10.1038/s41598-025-12211-3.
만성 위염은 A형과 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 감염에 의해 유발되는 B형으로 분류된다 [1]. A형 위염은 위의 체부에 해당하는 기저선(fundus gland) 영역에서 위축성 변화가 나타나는 것이 특징이며, 장기 특이적 면역질환인 자가면역성 위염(AIG)으로도 알려져 있다. 이는 위의 벽세포(parietal cell)가 파괴되어 내인자(intrinsic factor)의 소실과 위산 분비 감소로 이어지는 질환이다. 반면, B형 위염은 H. pylori 감염에 의해 유발되며, 위축성 변화가 유문부에서 체부까지 확장되는 것이 특징이다.
H. pylori 감염률이 높은 일본에서는 대부분의 위 점막 위축이 H. pylori 감염에 의해 발생한다. 최근 들어 H. pylori 감염률의 감소와 H. pylori 표적 치료제의 보급으로 인해 과거에는 드물게 여겨졌던 AIG가 주목받고 있다. AIG가 큰 주목을 받지 못한 또 다른 이유는 과거에 AIG가 북유럽의 고령 여성에게 흔한 질환으로 여겨졌기 때문이다 [1]. 하지만 Notsu 등 [2]의 최근 연구에 따르면 일본에서 내시경으로 검진한 6,793건 중 AIG의 빈도는 전체적으로 0.49%(여성 0.65%, 남성 0.40%)였으며, Terao 등 [3]의 다기관 연구에서는 전체 8,716건 중 AIG 유병률이 0.49%(43건)로 보고되었다. 이들 연구는 AIG가 일본에서도 흔하게 나타나는 질환임을 시사하며, 북유럽에 국한되지 않음을 보여준다. 반면, 해외 연구에서는 AIG의 유병률이 2.3%에서 10% 이상까지 보고되어 있으며 [4], 진단법의 발전에 따라 그 비율은 더 증가할 수 있다 [5].
H. pylori 제균 치료가 성공적으로 이루어지면, H. pylori에 대한 염증 반응이 사라지고, 위축된 점막 [6] 및 벽세포 기능이 개선되며, 감소된 위산 분비가 회복된다 [7]. 그러나 AIG는 위 벽세포에 대한 자가항체에 의해 벽세포가 파괴되며, 이로 인해 위산(염산 및 내인자) 분비가 감소하게 되어 [4], 제균 치료로는 큰 호전을 기대하기 어렵다. 이러한 자가항체가 생성되는 원인과 그 구체적인 기전은 아직 명확히 밝혀지지 않았으며, 따라서 AIG에 대한 치료법도 확립되지 않았고, 위축이나 위산 분비의 회복도 기대하기 어렵다. 따라서 AIG의 병태생리를 정밀하게 분석하여 예후, 예측, 치료에 유용한 정보를 얻는 것이 중요하다.
본 연구에서는 AIG 환자의 위장 미생물군 구성에 주목하였으며, AIG 병태생리에 관여하는 위장 박테리아, 이들의 발암과의 관련성, 질병 개선에 대한 가능성을 규명하는 것을 목표로 하였다.
여러 연구에서 H. pylori 감염이 자가면역 질환의 병태생리에 관여할 수 있다고 보고되었다 [8]. H. pylori에 대한 항체가 AIG에서 자가항체처럼 작용할 수 있다는 가능성도 제기되어 왔다. 예를 들어, H. pylori의 urease β 소단위는 위 벽세포의 ATPase β 소단위와 높은 상동성을 가지므로, 자가면역 반응을 유발할 수 있다 [9]. 따라서 AIG 환자와 H. pylori 감염 환자의 위장 미생물군을 비교하는 것은 중요하다. 그러나 현재 H. pylori에 감염된 환자는 위장 미생물군에서 H. pylori의 비율이 매우 높기 때문에, 비감염 환자와의 비교가 어렵다. 따라서 본 연구에서는 H. pylori 감염 이력이 있으나 제균 치료 후 현재는 감염되지 않은 위축성 위염 환자를 포함시켰다.
그러나 B형 위염과 AIG는 임상적으로 유사하기 때문에, 일본에서는 AIG 환자에게 H. pylori 제균 치료가 잘못 시행되는 경우가 있다. 실제로 일부 AIG 환자는 과거 H. pylori에 감염된 적이 있을 수 있다. 따라서 본 연구에서는 현재 감염 여부와 관계없이 1년 이상 전에 제균 치료를 받은 AIG 환자와, 과거 H. pylori에 감염되었고 제균 치료를 받은 만성 위축성 위염(B형) 환자를 비교 대상으로 삼았다.
두 환자군의 위장 미생물군을 비교 분석하여, H. pylori 제균 치료 후 위장 미생물군 구성의 차이를 규명하고자 하였다. 본 연구의 목적은 두 군 사이의 위 미세생태계 차이를 밝히고, H. pylori 음성 위암의 위험 인자가 될 수 있는 박테리아의 존재 여부를 조사하는 데 있다.
Results
Characteristics of patients with AIG
우리는 2018년 11월부터 2024년 11월 30일까지 교린대학병원(Kyorin University Hospital)을 방문하여 내시경 검사를 받은 위축성 위염 환자들을 대상으로 연구를 진행하였다. AIG(자가면역성 위염)로 진단된 환자 25명과, 과거 H. pylori 감염력이 있으며 제균 치료를 받고 1년 이상 경과한 위축성 위염 환자 26명으로부터 위 생검 검체를 수집하였다. 모든 환자는 연구 참여에 앞서 사전 동의서를 작성하였다.
16S rRNA 유전자 증폭 시퀀싱 분석이나 기타 진단 검사에서 H. pylori 양성으로 확인된 검체와 PCR 증폭이 충분하지 않았던 두 개의 검체는 제외되었다. 최종적으로 AIG 환자 20명과 위축성 위염(대조군) 환자 19명을 평가하였다(Fig. 1).
Fig. 1. Summary of the characteristics of patients included in this study.
AIG 환자들의 특징적인 소견은 표 1과 표 2에 제시되어 있다. 모든 AIG 환자는 혈청에서 벽세포 항체 또는 내인자 항체가 검출되었으며, 내시경 검사상 20명 중 17명은 위 체부(corpus)에 국한된 고도 위축 소견을 보였다. AIG 환자에서는 체부 우세 위축 소견이 85.7%로, 비-AIG 환자(0%)에 비해 유의하게 높은 비율을 보였다(P < 0.001). 특히, 이들 환자에서는 혈청 가스트린 수치가 높게 나타났다. 또한 AIG 환자 20명 중 1명(사례 A15)에서는 고농도의 항-H. pylori IgG가, 7명(사례 A2, A9, A12, A13, A16, A19, A20)에서는 저농도의 항-H. pylori IgG가 각각 검출되었다(표 2). AIG 및 위축성 위염 환자 모두에서, 내시경 소견과 16S 메타유전체 증폭 시퀀싱을 기반으로 검체 수집 시점의 H. pylori 감염은 음성으로 평가되었다.
Table 1. Characterization of patients with autoimmune gastritis in this study. *N/A:Not tested.
Table 2. Comparison between patients with autoimmune gastritis (AIG) and those with atrophic gastritis due to H. pylori-infection in this study. *Atrophic grade was defined as follows, O: open type, C: closed type , O-P:
Comparison of characteristics between patients with AIG and those with atrophic gastritis
AIG 환자군, 위축성 위염 대조군, 그리고 각 환자에게 시행된 마지막 제균 치료 요법에 대한 배경 정보는 표 2에 제시되어 있다. AIG 환자의 평균 연령은 67.8 ± 7.2세로, 대조군의 평균 연령인 60.8 ± 9.15세와 유의한 차이는 없었다. 성비는 AIG 환자군에서 남성:여성이 16:4였으며, 대조군에서는 11:8이었다. AIG 환자 20명 중 19명은 체부 우세 위축 여부와 관계없이 위축 정도가 O-3로 진단되었고, 단 한 명(사례 A2)만이 O-2로 진단되었다. 대조군에서는 10명이 폐쇄형 위축성 위염(C-2 또는 C-3)으로 진단되었다.
제균 치료를 받은 환자에 대해서는 치료 시작 시점부터 검체 채취 시점까지의 기간을 계산하였다. 두 군 간에는 유의한 차이가 있었으며, AIG군은 평균 1년, 대조군은 3.5 ± 1.7년이었다(P < 0.01). 요소호기검사(UBT)의 평균 수치는 AIG군에서 14.1 ± 26.4‰로, 대조군의 0.9 ± 0.7‰보다 유의하게 높았다(P < 0.01). 카이제곱 검정 결과, 제균 치료를 받은 횟수는 AIG군이 대조군보다 유의하게 많았다.
Gastric microbiota in patients with AIG and those with atrophic gastritis
AIG 환자의 위 체부(corpus)와 유문부(antrum)의 위장 미생물군은 주로 Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidota, Fusobacteria, Actinobacteria의 다섯 문(phylum)으로 구성되어 있었다(Fig. 2A). AIG 환자의 위 유문부 및 체부에서 Bacteroidota의 상대적 풍부도(abundance)는 대조군의 위 체부 및 유문부보다 유의하게 낮았다(P < 0.05 및 P < 0.01). 반면, AIG 환자의 위 체부에서 Proteobacteria의 상대적 풍부도는 대조군의 위 체부 및 유문부보다 유의하게 높았으며(P < 0.01), AIG 환자의 위 유문부에서도 대조군 유문부보다 유의하게 높은 것으로 나타났다(P < 0.05).
Firmicutes 문은 주로 Streptococcus 속(genus)으로 구성되어 있었으며, AIG 환자에서 Streptococcus 속의 풍부도는 대조군보다 위 체부와 유문부 모두에서 유의하게 높았다(P < 0.05). Bacteroidetes 문은 Prevotella, Prevotella 7, Porphyromonas, Alloprevotella, Capnocytophaga 속으로 구성되어 있었다(Fig. 2B). 이 중 AIG 환자의 위 체부에서 Prevotella 속의 풍부도는 대조군의 위 유문부에 비해 유의하게 낮았다(P < 0.05).
Fig. 2. The microbiota composition in the gastric corpus or gastric antrum of patients with autoimmune gastritis and atrophic gastritis. The relative abundance of bacterial phyla (A) and genera (B).
* 알파다양성: 미생물 무리 자체의 다양성 (얼마나 많은 수의 미생물이 있는지 (richness)와 얼마나 고르게 분포되어 있는지 (evenness))
* 베타다양성: 미생물 무리 구성이 대조군의 미생물 무리 구성과 어떻게 다른가에 대한 내용 (상대적인 값)
Alpha diversity of gastric microbiota in patients with AIG and those with atrophic gastritis
위장 미생물군의 알파 다양성(alpha diversity)과 관련하여, AIG 환자의 위 체부(corpus)와 유문부(antrum) 모두에서 Shannon 지수, Pielou의 균등도(evenness) 지수, 그리고 Simpson 지수가 대조군에 비해 유의하게 낮았다(Fig. 3A–C). 반면, Chao-1 지수는 대조군과 AIG 군 간에 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 3D).
Fig. 3. Alpha diversity according to gastric bacterial compositions in patients with autoimmune gastritis and those with chronic gastritis after Helicobacter pylori eradication. Chao-1 (A), Shannon (B), Pielou’s evenness (C), and Simpson (D) indices are represented in samples from each group of patients. *Statistically significant (**: P < 0.01, *: P < 0.05).
Beta diversity of gastric microbiota in patients with AIG and those with atrophic gastritis
우리는 비가중 및 가중 UniFrac 계통 거리(unweighted and weighted UniFrac phylogenetic distance) 지표를 사용하여 베타 다양성(beta diversity)을 계산하고, 주좌표 분석(PCoA) 그래프로 시각화하였다. 그 결과, AIG 환자의 위 체부(Fig. 4A, B)와 유문부(Fig. 5A, B)의 미생물군 구성은 만성 위염 환자와 유의하게 다르게 나타났으며, 이는 가중 UniFrac 거리 기반 PERMANOVA 분석을 통해 확인되었다(Fig. 4B; q = 0.00062, Fig. 5B; q = 0.00004). 반면, 비가중 UniFrac 거리에서는 AIG와 위축성 위염 환자 간에 위 체부 및 유문부 모두에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다(Fig. 4A 및 Fig. 5A).
Fig. 4. Principal coordinate analysis (PCoA) plots of unweighted (A) and weighted UniFrac distances (B) in which gastric corpus samples were colored according to clinical outcome (blue: AIG, orange: atrophic gastritis). The percentage of diversity captured by each coordinate is shown. PERMANOVA, analysis of similarity.
Fig. 5. Principal coordinate analysis (PCoA) plots of (A) unweighted and (B) weighted UniFrac distances in which gastric antrum samples were colored according to clinical outcome (blue: AIG, orange: atrophic gastritis). The percentage of diversity captured by each coordinate is shown. PERMANOVA, analysis of similarity.
Association of specific microbiota taxa with AIG and atrophic gastritis according to Microbiome Multivariable Association with Linear Models 2 (MaAsLin 2)
두 그룹 간 임상 진단의 차이에 기여하는 주요 균주(taxa)를 확인하기 위해, 우리는 위 체부(corpus)와 유문부(antrum)의 미생물군에 대해 Microbiome Multivariable Association with Linear Models 2 분석을 수행하였다. 그 결과, AIG 환자의 위 체부에서는 Haemophilus, Streptococcus, Bergeyella 속이 검출되었으며, 위축성 위염 대조군의 위 체부에서는 Cutibacterium, Centipeda, Candidatus_Saccharimonas 속이 유의하게 더 높은 수준으로 존재함이 확인되었다(Supplementary Fig. 1).
Supplement Fig. 1. Comparative study for the abundance of genera in gastric corpus microbiota between the AIG patients and control patients with atrophic gastritis using MaAsLin 2 as a linear model. The genera Cutibacterium, Centipeda, and Candidatus_Saccharimonas were shown significantly higher abundance in control patients, and the genera Bergeyella and Haemophilus were significantly higher abundance in the AIG patients.
또한 AIG 환자의 위 유문부에서는 Streptococcus 속이 검출되었고, 위축성 위염 대조군의 위 체부에서는 Selenomonas 및 Candidatus_Saccharimonas 속이 유의하게 많이 존재하는 것으로 나타났다(Supplementary Fig. 2).
Supplement Fig. 2. FDR: 1.282e−01 Coefficient: 2.56e+00 Value: GI 0.075 0.050 0.025 0.000 diagnosis AIG (n=20) GI (n=19) Comparative study for the abundance of genera in gastric antrum microbiota between the AIG patients and control patients with atrophic gastritis using MaAsLin 2 as a linear model. The genus Streptococcus was shown in significantly higher abundance in AIG patients, and the genera Selenomonas and Candidatus Saccharimonas were shown in significantly higher abundance in control patients.
제균 치료 이후 경과 시간(년 단위)을 독립 변수로 하여 MaAsLin 2 선형 모델을 이용해 분석한 결과, 여러 유의한 시간적 상관관계를 확인하였다. Micrococcales 목(order)과 Acidiphilium 및 MN_122.2a 속(genus)은 시간 경과에 따라 유의한 양의 상관관계를 보였으며(Fig. 6A 및 B), 반면 Granulicatella 속은 동일한 기간 동안 유의한 음의 상관관계를 나타냈다.
Fig. 6. MaAsLin2 significant results and associations between facter (year of age), and gastric microbiota composition of gastric corpus (A), and antrum (B). Diagnosys means AIG(blue) vs control with atrophic gastritis (red) patients.
Discussion
정상 위의 환경은 산성이며, 일반적으로 세균 성장에 불리한 것으로 간주된다. 그러나 분자 생물학적 분석을 활용한 여러 연구에 따르면, 산성의 위 환경에서도 세균이 정착할 수 있음이 밝혀졌다 [10]. 여러 연구들 [11,12]에 따르면, 건강한 개인의 위장 미생물군은 주로 Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Fusobacteria의 다섯 가지 문(phylum)으로 구성된다. AIG에서는 위 벽세포의 산 분비 기능이 소실되기 때문에 위 내 환경이 저산성(hypochlorhydria) 상태가 된다. 이러한 독특한 위 내 환경으로 인해, AIG 환자의 위장 미생물군 구성은 건강한 정상 위와 다를 것으로 예상되었다. 그러나 본 연구에서 AIG 환자의 위 미생물 분석 결과, 정상 위에서 우세한 다섯 문이 AIG 환자에서도 동일하게 우세하게 나타났다.
세포학 브러시(cytology brush) 검체를 이용한 한 인구 기반 연구에서는 위장 증상이 있는 환자와 없는 환자의 위장 미생물군 구성을 보고하였다 [13]. 위장 증상이 없는 환자의 위장에서는 Firmicutes(42%), Bacteroidetes(24%), Proteobacteria(17%), Actinobacteria(7%), Fusobacteria(6%)가 존재하였으며, 이는 본 연구 결과와 일치하였다. 이 결과는 제균 치료를 받은 대조군의 위장 미생물군 구성이, 위염이 잔존해 있음에도 불구하고 건강한 사람의 미생물군 구성과 유사하다는 것을 시사한다.
한편, AIG 환자의 위장 미생물군에서 Bacteroidota의 풍부도는 위축성 위염 환자보다 유의하게 낮았고, 위 체부에서 Proteobacteria의 풍부도는 위축성 위염 환자의 위 체부 및 유문부보다 유의하게 높았다. 각 군에서 Proteobacteria와 Bacteroidetes의 상대 비율(P/B ratio)을 계산한 결과, AIG 환자에서 평균 P/B 비율이 대조군보다 유의하게 높았다(데이터 미제시). 이는 AIG 환자가 제균 치료 후에도 정상적인 위장 미생물군을 재구성하지 못할 수 있으며, 이는 정상적인 산 분비 회복의 실패 때문일 수 있음을 시사한다.
여러 연구 [13–15]에 따르면, H. pylori 감염은 위장 미생물군의 알파 다양성을 감소시키며, 이는 H. pylori가 다른 균주보다 우세해지는 결과와 관련된다. H. pylori는 다른 위장 균주들과 상호작용하며, 알파 다양성과 음의 상관관계를 가진다 [16]. 따라서 H. pylori 제균에 성공하면 OTU(operational taxonomic units) 수와 Chao-1 지수가 증가하게 된다. 본 연구에서는 H. pylori 비감염 상태인 AIG 및 위축성 위염 환자의 위 미생물군 알파 다양성이 높을 것으로 예상하였으나, 그 수준이 건강한 사람과 같은지는 불분명하였다. 본 연구에서 두 군의 OTU 중앙값은 100–200 범위였던 반면, 건강한 사람의 위 미생물군에서는 400개 이상의 OTU가 보고되었다 [16]. 따라서 알파 다양성 측면에서 AIG 및 대조군 모두는 건강한 사람과는 다른 상태에 있었으며, 이는 이전의 제균 치료에 기인했을 가능성이 있다.
Yang 등 [17]의 연구에서는 제균 치료를 받은 환자들을 성공군과 실패군으로 나누어 분석하였다. H. pylori 제균에 성공한 환자들은 알파 다양성이 더 높았으나, 베타 다양성에서는 차이를 보이지 않았다. 위축성 위염의 경우 H. pylori 제균 이후에도 위산 분비의 완전한 회복은 어려운 것으로 알려져 있다.
또한, H. pylori 유도 위축성 위염, AIG, 그리고 PPI(프로톤 펌프 억제제) 복용자 간의 위장 미생물군 비교 연구도 보고되었다 [18]. AIG 환자와 PPI 복용자의 위 생검 검체는 H. pylori 유도 위축성 위염 환자보다 더 높은 세균 다양성을 나타냈다.
이번 AIG와 위축성 위염 환자 간의 비교 연구에서는 AIG 환자의 위장 미생물군에서 Shannon 지수, Pielou의 균등도, Simpson 지수가 모두 대조군보다 유의하게 낮았다. 반면, Chao-1 지수는 두 군 간 유의한 차이가 없었다. 이러한 특징은 대조군에서는 관찰되지 않았으며, AIG 환자에서의 공복 혈청 가스트린 농도 상승과 관련이 있을 수 있다(표 1 참조). Shannon 및 Simpson 지수의 감소는 미생물 군집의 다양성 저하를 나타내며, Pielou의 균등도 감소는 균주 간 분포가 고르지 않음을 의미한다. 따라서 AIG와 관련된 특정 균주 특성이 위장 미생물군의 구성에 강한 영향을 미쳐 알파 다양성에 영향을 미치는 것으로 보인다.
또한, 위 유문부의 미생물군에서 Sphingobium 속의 풍부도와 혈청 가스트린 농도 간에 유의한 상관관계가 확인되었으며(p = 0.000212, q = 0.031637), 위 체부에서는 이러한 상관관계가 나타나지 않았다. H. pylori에 감염되지 않은 피험자에서는 나이에 따라 Proteobacteria, 특히 Enhydrobacter, Comamonadaceae, Sphingobium 속이 증가한다는 보고도 있었다 [19]. Sphingobium 속이 위에서 어떤 역할을 하며 가스트린과 어떤 관계가 있는지는 아직 밝혀지지 않았으며, 추가 연구가 필요하다.
과거 AIG 환자와 비-AIG 환자의 위장 미생물군을 비교한 Tsuboi 등 [20]의 연구에서는, AIG 환자에서 Streptococcus, Selenomonas, Granulicatella, Bacillus spp. 등의 속이 대조군보다 유의하게 더 많이 존재함을 보고하였다. 이 연구에서도 AIG 환자 14명 중 10명(71.43%)이 제균 치료를 받은 이력이 있어, 본 연구와 유사한 비교 구조를 보인다. 본 연구에서도 AIG 환자의 위 유문부에서 Streptococcus 및 Granulicatella 속의 풍부도가 높았고, 위 체부에서도 Streptococcus 속이 증가해 있었다. Streptococcus 및 Granulicatella 속은 위축 및 장상피화생의 발생 및 지속과도 연관되어 있다고 보고되었다 [21]. Granulicatella는 뿌리관 감염과 관련된 그람 양성 조건혐기성 세균이며 [22], Streptococcaceae의 상대적 풍부도는 PPI 복용 환자에서 복용하지 않은 환자보다 유의하게 높았고, Streptococcus 속의 풍부도는 H. pylori 감염 여부와 무관하게 PPI 복용에 따라 증가하였다 [23]. 이는 H. pylori가 위에 없고 위산 분비가 저하된 상태가 Streptococcus 속 증가에 기여할 수 있음을 시사한다.
H. pylori 감염과 위암 발생률 간의 관계는 잘 알려져 있으나, AIG와 위암 발생률 간의 관계는 아직 불분명하다. H. pylori 제균 후 3년 이상 장기간 PPI를 복용한 경우, 위산 분비 저하로 인한 장기적인 dysbiosis가 위암 발생에 기여하여 비심부(noncardiac) 위암의 발생률이 2.4배 증가했다는 보고도 있다 [24]. 위암 환자의 위장 미생물군은 장내 공생균 및 구강 유래 Streptococcus, Prevotella 등의 속이 증가한 특징을 보였으며 [25,26], 메타분석에서는 위암 환자에서 Fusobacterium, Parvimonas, Veillonella, Prevotella, Peptostreptococcus 등의 기회감염균이 증가하고 Bifidobacterium, Bacillus, Blautia 등의 공생균이 감소했다는 결과가 있었다 [27]. 그러나 본 연구에서는 AIG 환자에서 Streptococcus 속이, 위축성 위염 대조군에서는 Prevotella 속이 더 풍부하게 나타났다. 동물실험에서는 Streptococcus anginosus가 발암을 유도한다는 보고도 있었으며 [28], 향후 연구에서는 이러한 균의 보유 정도를 개별적으로 확인할 필요가 있다.
PPI를 대체하여 상부 위장관 질환 치료에 사용되고 있는 칼륨 경쟁성 산 차단제(PCABs)는 H. pylori 제균 환자에서 위암 위험을 증가시키며, 복용 기간 및 용량에 따라 반응 효과가 관찰된다 [29]. 본 연구에서는 PPI 및 PCAB 장기 복용자는 제외되었으나, 향후 연구에서는 이들을 포함한 비교 분석이 필요하다.
최근 Rugge 등 [30]은 일반 인구와 비교했을 때, 위 체부에 국한된 염증 및 위축 소견이 위암 발생 위험을 증가시키지 않는다고 보고하였다. 그들은 장기 추적 병리학적 연구를 통해, H. pylori 음성 AIG 환자에서 자연경과, 조직학적 표현형, 암 발생 위험을 분석하였다. 총 10,541 인년의 누적 추적 기간 동안 위암이나 기타 암의 위험 증가는 없었으며, 단지 갑상선암의 위험이 경계선상 유의성(marginal significance)을 보였다. 해당 연구에 대한 견해 차이가 있긴 하나 [31], H. pylori가 존재하지 않고 위산 분비가 저하된 환경에서는 위암과 관련된 박테리아에 의해 위암 위험이 이론적으로 증가할 수 있다는 우려가 있다.
위 벽세포의 프로톤 펌프는 항벽세포 자가항체의 표적이 되며, 항내인자 자가항체도 함께 나타난다. 이러한 자가항체 생성 기전에는 H. pylori 감염에 의해 손상된 벽세포 항원에 대한 T세포 반응이 포함되며 [32], 세균과 숙주 분자 간의 구조적 유사성에 의해 자가항체가 유도되는 병태기전은 여러 자가면역질환에서 관찰된다. 본 연구에서는 AIG 환자가 H. pylori에 감염된 병력이 있는지를 명확히 밝히지는 않았으나, 15명의 환자 중 6명에게서 항-H. pylori IgG 항체가 검출되었고, 이 중 2명은 항체 역가가 특히 높았다(표 2 참조). AIG 환자는 소장에서 비타민 B12를 정상적으로 흡수하지 못하기 때문에 악성빈혈 및 말초신경병증의 위험이 증가한다. 따라서 AIG의 병태생리를 정밀하게 분석하는 것은 예후 예측과 치료 전략 수립에 있어 매우 중요하다.
본 연구에서는 각 환자에게서 위 체부와 유문부에서 각각 하나씩 총 두 개의 위 생검 조직을 채취하였다. AIG 환자에서는 위축이 반대 양상(inverse atrophy)을 보이는 특성이 있어, 위 부위에 따라 위장 미생물군 구성이 다를 수 있다고 가정하였다. 그러나 위 부위에 따른 미생물군 구성의 뚜렷한 차이는 관찰되지 않았다. 위 체부와 유문부의 위장 미생물군 간 베타 다양성을 비교하기 위해 weighted 및 unweighted UniFrac 거리를 사용한 PERMANOVA 분석 결과, 유의한 차이는 없었다. 이는 AIG 환자에서 위축 정도가 위 전체로 퍼져 있었을 가능성을 시사한다.
본 연구에는 몇 가지 한계점이 있다. 첫째, AIG 환자의 표본 수가 적었다. 둘째, 위축성 위염 대조군에서 제균 치료 후 경과 기간이 AIG 환자보다 유의하게 길었다. 셋째, AIG 환자의 위축 정도가 대조군보다 더 심했을 가능성이 있다. 이러한 요소들은 위장 미생물군 구성에 영향을 미쳤을 수 있으며, 향후 더 많은 사례를 포함한 연구가 필요하다.
결론적으로, 제균 치료 이후 AIG 환자의 위장 미생물군 구성은 만성 위염 환자와 유의하게 달랐으며, Shannon 지수, Pielou의 균등도, Simpson 지수 등 알파 다양성이 감소하였다. AIG 환자의 위장 미생물군은 Streptococcus 속의 풍부도가 증가하고 Prevotella 속의 풍부도는 감소한 특징을 보였다.
Materials and methods
Participants
2018년 11월 28일부터 2021년 7월 30일까지 교린대학병원(Kyorin University Hospital)에서 내시경을 위해 내원한 자가면역성 위염(AIG) 환자와 위축성 위염을 가진 대조군 환자들이 본 연구에 등록되었습니다. AIG는 내시경 소견 및 혈청학적으로 진단되었습니다[5]. 간단히 말해, 혈청에서 항위벽세포 항체 또는 항내인자 항체, 또는 두 항체 모두가 검출된 경우 AIG로 진단하였습니다. 대조군은 교린대학병원에서 H. pylori 감염으로 진단받고 1차 또는 2차 제균 치료를 받은 후 현재 H. pylori 음성 상태인 환자들이었습니다(그림 1 참조).
1차 제균 요법은 클라리트로마이신(CLR) 400mg 1일 2회, 아목시실린(AMX) 750mg 1일 2회, 그리고 PPI 또는 보노프라잔(P-CAB)을 7일간 투여하는 방식이었습니다. 1차 요법으로 H. pylori 제균에 실패한 경우, 2차 요법으로 PPI 또는 P-CAB, 메트로니다졸(MNZ) 250mg 1일 2회, AMX 750mg 1일 2회를 7일간 투여하였습니다. 1차 및 2차 요법으로도 제균에 실패한 환자에게는 고용량 AMX와 P-CAB를 14일간 투여하거나, 시타플록사신, AMX, P-CAB를 7일간 투여하는 3차 요법을 시행하였습니다.
13C-요소호기검사(13C-UBT)를 통해 제균 성공 여부를 확인하였습니다. 대조군 위축성 위염 환자들은 과거 H. pylori에 감염되었으나, 만성 위염에 대한 제균 치료를 받았고, 본 연구 당시에는 H. pylori에 감염되지 않은 상태였습니다.
이 연구는 헬싱키 선언(Declaration of Helsinki) 및 인간 대상 연구에 대한 윤리심사 절차를 준수하여 수행되었으며, 도쿄 교린대학교 윤리위원회(승인번호 624-04)의 승인을 받았습니다.
Biopsy specimens and DNA extraction
위 미생물군 분석을 위해 위체부(A)와 전정부(B)에서 내시경 시 위 생검 조직을 채취하였습니다. 신선한 검체는 DNA/RNA Shield 용액(Zymo Research, Irvine, CA, USA)에 넣어 4 °C에서 사용 전까지 보관하였습니다. 조직 샘플은 10,000 × g로 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였습니다. 전체 DNA는 제조사 지침에 따라 QIAamp Power Fecal Pro DNA Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 추출하였습니다. PCR 증폭 효율을 향상시키기 위해, 충분히 증폭되지 않은 경우에는 추출된 DNA에서 숙주 DNA를 제거하였습니다. 이 DNA 제거는 NEBNext® Microbiome DNA Enrichment Kit(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)를 제조사 지침에 따라 수행하였습니다.
16S rRNA gene amplicon sequencing analysis
위 생검 조직에서 추출된 총 DNA(< 12.5 ng)는 16S rRNA의 V3–V4 영역을 표적하여 증폭하였습니다. 증폭에는 포워드 프라이머(5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3′)와 리버스 프라이머(5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)가 사용되었으며, 프라이머에는 태그(tag) 영역이 포함되어 있었습니다. 1차 PCR 반응은 Platinum II Hot-Start PCR Master Mix(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA, USA)를 사용하여, 95 °C에서 3분간 초기 변성과 이어서 95 °C에서 30초, 55 °C에서 30초, 72 °C에서 30초의 조건으로 30–35회 반복한 후, 최종적으로 72 °C에서 5분간 반응시켜 수행하였습니다.
생성된 증폭산물은 제조사 지침에 따라 Nextera XT Index Kit(Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)를 이용하여 이중 인덱스(dual indices) 및 Illumina 시퀀싱 어댑터를 결합시켰습니다. 증폭산물의 시퀀싱은 Illumina MiSeq 시스템(Illumina)을 사용하여 수행하였습니다.
획득된 시퀀스 데이터는 Kraken2 소프트웨어 [33]를 이용하여 인간 참조 유전체(GRCh38)에 정렬하여 숙주 유래 시퀀스를 제거하였고, 남은 시퀀스는 QIIME2 (2019년 10월 버전) 파이프라인 [34]을 통해 분석하였습니다. 숙주가 아닌 paired-end 시퀀스는 DADA2 플러그인을 사용하여 품질 필터링, 노이즈 제거, 병합 및 키메라 제거 과정을 거쳤습니다. DADA2 [35]를 통해 얻은 amplicon sequence variants(ASVs)에 대해 SILVA 데이터베이스 v138.1 [36]을 기반으로 feature-classifier-classify sklearn 플러그인을 사용하여 분류학적 정보를 부여하였습니다.
각 샘플의 마이크로바이옴의 알파 다양성은 Chao-1, Pielou’s evenness, Shannon, Simpson 지수를 사용하여 평가하였습니다.
Statistical analysis
AIG군과 대조군 간의 차이의 유의성은 Wilcoxon 순위합 검정(Wilcoxon rank-sum test)을 사용하여 평가하였습니다. 군 간의 베타 다양성 차이는 PERMANOVA(permutational multivariate analysis of variance)를 이용하여 비교하였습니다. 또한 AIG 환자와 대조군 간의 미생물 바이오마커를 확인하기 위해 MaAsLin2(Microbiome Multivariable Associations with Linear Models) 분석도 수행하였습니다 [37].
<Abstract>
Fundamental treatments for autoimmune gastritis (AIG) have not yet been established; thus, analyzing AIG pathogenesis in detail to obtain useful information for prognosis prediction and treatment is crucial. This study explored bacteria involved in AIG pathogenesis by focusing on the gastric microbiota composition. Gastric biopsy tissues were collected endoscopically from the gastric corpus and antrum of patients with AIG and chronic gastritis. Total DNA was extracted from gastric biopsy specimens and used for 16S rRNA gene amplicon sequencing analysis. Principal coordinate analysis of diversity using the weighted UniFrac distance revealed that following Helicobacter pylori eradication, the gastric bacterial composition of patients with AIG differed significantly from that of patients with chronic gastritis, exhibiting decreased Shannon index, Pielou's evenness, and Simpson index of alpha diversity. The gastric microbiota of patients with AIG was characterized by an increased abundance of the genus Streptococcus and a reduced abundance of the genus Prevotella compared with that of patients with chronic gastritis.
Keywords: Helicobacter pylori; Autoimmune gastritis; Chronic gastritis; Genus Prevotella; Genus Streptococcus; Microbiota.
자가면역성 위염(AIG)에 대한 근본적인 치료법은 아직 확립되어 있지 않으므로, 예후 예측 및 치료에 유용한 정보를 얻기 위해 AIG의 병태생리를 면밀히 분석하는 것이 중요하다. 본 연구는 AIG 병태생리에 관여하는 균주를 규명하기 위해 위장 미생물군의 구성에 초점을 맞추었다. AIG 및 만성 위염 환자의 위 체부(corpus)와 유문부(antrum)에서 내시경을 통해 위 생검 조직을 채취하였고, 총 DNA를 추출하여 16S rRNA 유전자 증폭 시퀀싱 분석을 수행하였다.
가중 UniFrac 거리 기반의 다양성 주좌표 분석(principal coordinate analysis) 결과, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 제균 치료 이후 AIG 환자의 위장 미생물 조성은 만성 위염 환자와 유의하게 다름을 보였으며, AIG 환자군에서 Shannon 지수, Pielou의 균등도 지수, Simpson 지수 등 알파 다양성이 감소한 것이 확인되었다. 또한 AIG 환자의 위장 미생물군은 만성 위염 환자에 비해 Streptococcus 속의 풍부도는 증가하고, Prevotella 속의 풍부도는 감소한 것이 특징적으로 나타났다.