Otani K, Nakatsu G, Fujimoto K, Miyaoka D, Sato N, Nadatani Y, Nishida Y, Maruyama H, Ominami M, Fukunaga S, Hosomi S, Tanaka F, Imoto S, Uematsu S, Watanabe T, Fujiwara Y.
J Gastroenterol. 2025 Sep 11. doi: 10.1007/s00535-025-02298-w.
* 알파다양성: 미생물 무리 자체의 다양성 (얼마나 많은 수의 미생물이 있는지 (richness)와 얼마나 고르게 분포되어 있는지 (evenness))
* 베타다양성: 미생물 무리 구성이 대조군의 미생물 무리 구성과 어떻게 다른가에 대한 내용 (상대적인 값)
Introduction
자가면역성 위염(AIG)은 위체부의 만성 위축성 위염을 특징으로 하며, 위벽세포에 대한 자가항체에 의해 면역 매개적으로 위벽세포가 파괴되어 무산증(achlorhydria)과 고가스트린혈증(hypergastrinemia)이 발생한다 [1]. 일본소화기내시경학회 산하 연구회에서는 AIG의 진행 단계 진단 기준을 제안하였는데, 여기에는 AIG를 시사하는 내시경 또는 조직학적 소견과 위벽세포 항체 혹은 내인자 항체의 존재가 포함된다. AIG 연구위원회는 역위축(reverse atrophy) 양상 외에도 산분비 점막의 잔존(remnants of oxyntic mucosa), 끈적하고 조밀하게 부착된 점액(sticky adherent dense mucus), 산재된 작은 백색 돌기(scattered minute whitish protrusions) 등 AIG의 여러 내시경적 특징을 제시하였다 [2]. 최근 수년간 AIG의 진단 기준과 내시경 소견이 점차 규명되면서, 이 질환에 대한 관심과 주목이 크게 증가하였다.
AIG의 진단적 의의는 AIG의 가장 어려운 합병증 중 하나인 위 신경내분비종양(NETs) 발생의 고위험군을 평가하는 데 있다. 위 NETs의 분류에는 Rindi 분류가 널리 사용되며, AIG는 제1형(type I) NETs의 전구 병변이다 [3]. AIG 환자에서 위 NETs의 발생률은 0.7~15.4%로 보고되어 있다 [4]. 고가스트린혈증은 AIG에서 위 NETs와 연관이 있으며 [5], 위 점막의 ECL(enterochromaffin-like) 세포 증식을 자극하여 위 NETs 발생 위험을 높이는 것으로 알려져 있다 [6]. 그러나 AIG 환자에서 위 NETs 형성에 관여하는 병태생리학적 세부 기전은 여전히 잘 밝혀지지 않았다.
위는 강한 산성 환경을 갖기 때문에, 오랫동안 요소분해효소를 생성하는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)를 제외한 대부분의 세균에게는 불리한 환경으로 여겨져 왔다. H. pylori는 위암의 주요 위험인자이다 [7]. 그러나 분자생물학적 분석에 따르면 Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteriota, Bacteroidota, Fusobacteriota 등 다양한 세균이 인간 위 미생물총을 구성하는 것으로 밝혀졌다 [8]. 이전 연구에서는 위 점막 연관 미생물총의 다양성이나 구성이 변형되는 이생균총(dysbiosis)이 H. pylori 제균 치료 후에도 지속되며, 이는 이시성 위암(metachronous gastric cancer)의 발생에 기여한다는 사실을 보여주었다 [9]. 또한 AIG에서도 무산증에 의해 위 점막 연관 미생물총의 이생균총이 관찰되며, AIG는 H. pylori 유발 위축성 위염과는 다른 미생물 프로파일을 보이는 것으로 보고되었다 [10].
위장을 넘어 위장관(GI tract)의 미생물총은 염증성 장질환을 포함한 여러 자가면역질환과 관련이 있다고 알려져 있다 [11,12]. 또한, GI 미생물총과 선암종(adenocarcinoma)의 연관성을 조사한 연구는 존재하지만 [13], GI 미생물총과 NETs 간의 관계를 살펴본 연구는 매우 드물다. 더 나아가 NETs와 대사 경로 간의 관계는 NET 환자의 혈장 대사체 분석을 통해 연구된 바 있다 [14]. 그러나 AIG 환자에서 대사 경로의 변화를 다룬 보고는 현재까지 없다.
따라서 본 연구에서는 위 조직의 미생물총과 대사 프로파일 변화를 분석하고, 이들이 AIG의 병태생리 및 위 NETs 형성에 기여할 가능성을 조사하였다.
Methods
Study design
This was a single-center, observational study.
Study population
총 19명의 AIG 환자와 H. pylori에 감염되지 않았고 AIG가 없는 대조군 12명이 연속적으로 등록되었다. 19명의 AIG 환자 중, 병리조직학적 검사에서 위 NET이 발생한 7명은 NET 양성군으로 분류하였고, 위 NET이 발생하지 않은 12명은 NET 음성군으로 분류하였다.
Eligibility criteria of the study population
포함 기준은 다음과 같다. 2020년 10월부터 2023년 2월 사이 오사카 시립대학병원에서 연구 참여에 동의한 만 18세 이상의 환자 중, 아래에 기술된 AIG 진단 기준에 따라 AIG로 확진된 환자를 연속적으로 AIG군에 등록하였다. 대조군은 내시경 평가에서 H. pylori에 감염되지 않았으며, 제균 치료 병력이 없고, 항–H. pylori 항체 혈청검사, 병리조직학적 검사, 또는 대변 H. pylori 항원검사를 통해 H. pylori 음성으로 확인된 환자 중에서 AIG 환자와 연령(±10세)과 성별을 매칭하여 등록하였다.
제외 기준은 다음과 같다. 연구 참여에 동의하지 않았거나, 연락 후 참여를 거부한 환자는 제외하였다.
Diagnostic criteria for autoimmune gastritis
본 연구에서 AIG는 위벽세포 항체 또는 내인자 항체의 존재, 상부 위장관 내시경에서 관찰된 위체부의 광범위한 위축, 그리고 24시간 임피던스-pH 모니터링을 통해 확인된 무산증을 근거로 진단하였다.
Outcome measurement
이 연구의 주된 목적은 위 NET 동반 여부에 따른 AIG 환자에서 위 점막 연관 미생물총과 숙주 조직 유래 대사체 프로파일의 변화를 조사하고, AIG에서 위 NET 형성의 근본적인 기전을 규명하는 것이었다.
Sample collection
위 점막 생검 검체는 상부 위장관 내시경 동안 모든 참가자에게서 미리 정의된 네 부위에서 채취하였다: 전정부 대만(A1), 위각 소만(A2), 체부 소만(B1), 체부 대만(B2). 채취된 검체는 미생물군 및 대사체 분석을 위해 즉시 냉동 보관하였다.
Medications
환자들은 AIG 진단을 위한 24시간 임피던스-pH 모니터링 시행 2주 전부터 위산 억제제를 중단하였다. 무산증이 확인되고 AIG가 진단된 이후에는 어떤 위산 억제제도 처방되지 않았으며, 미생물군 및 대사체 분석을 위한 위 점막 생검 시점에도 이러한 약물을 복용하지 않았다. 대조군 환자들 또한 위 점막 생검 시행 2주 전부터 위산 억제 치료를 중단하였다. 규칙적으로 항생제 치료를 받고 있는 환자는 본 연구에 포함되지 않았다.
DNA extraction for microbiome analysis
위 점막 생검 검체는 10× Tris–EDTA (TE) 완충용액이 담긴 마이크로 원심분리 튜브에 넣었다. 이후 라이소자임 용액(계란 흰자 유래 Lysozyme; Merck KGaA, Darmstadt, Germany)을 첨가하고 37 °C에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어서 아크로모펩티다제(Achromopeptidase, Purified, Lytic Enzyme [TBL-1]; FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp., Osaka, Japan)를 첨가하고 37 °C에서 30분간 반응시켰다. 그 다음 Proteinase K (Tritirachium album 유래; Merck)와 20% Sodium Dodecyl Sulfate 용액(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.)을 첨가한 후, 혼합물을 55 °C에서 1시간 동안 반응시켰다.
Phenol–chloroform 추출은 UltraPure™ Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) (Thermo Fisher Scientific, Inc., MA, USA)을 첨가한 후 원심분리하여 수행하였다. 수상층은 새로운 튜브로 옮긴 뒤 3 M sodium acetate(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.)와 isopropanol을 첨가하였다. 원심분리 후 생성된 펠릿을 75% 에탄올로 세척하고 다시 원심분리한 뒤 공기 중에서 건조하였다.
펠릿은 Ribonuclease (DNase free) Glycerol Solution (Nippon Gene Co., Ltd., Tokyo, Japan)이 포함된 1× TE 완충용액에 재부현(resuspension)하여 37 °C에서 30분간 반응시켰다. DNA는 추가적으로 20% polyethylene glycol 용액(50% w/v Polyethylene glycol 6000; Hampton Research Corp., CA, USA)을 첨가한 뒤 원심분리하여 정제하였다. 최종적으로 생성된 펠릿은 75% 에탄올로 세척 후 원심분리하고 건조한 뒤, 0.5× TE 완충용액에 다시 부현하였다.
Microbiome analysis
16S rRNA 유전자의 V3–V4 영역 시퀀스는 이전에 보고된 방법에 따라 준비하였다 [15,16]. 간단히 말해, V3와 V4 영역을 포함한 16S rRNA 유전자 절편은 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 증폭하였다(Forward primer: ACA CGA CGC TCT TCC GAT CTC CTA CGGGNGGC WGC AG; Reverse primer: GAC GTG TGC TCT TCC GAT CTG ACT ACHVGGG TAT CTA ATC C). PCR은 20~30 사이클 동안 수행하였으며, 생성된 PCR 산물은 Agencourt AMPure beads(Beckman Coulter)를 사용해 정제하였다.
다음으로, 시퀀싱을 위해 NEBNext Multiplex Oligos for Illumina(Dual Index Primers Set1, New England Biolabs)를 이용해 8 사이클 동안 두 번째 PCR을 수행하여 인덱스 서열을 부가하였다. 이 산물 역시 Agencourt AMPure beads로 정제하였다.
각 샘플에서 동일한 양의 DNA 앰플리콘 라이브러리를 혼합한 뒤, MiSeq 장비(Illumina)에서 MiSeq v3 Reagent kit와 15% PhiX를 사용하여 시퀀싱을 수행하였다.
Sample preparation for metabolome analysis
위 점막 생검 조직 검체는 내부 표준물이 포함된 50% 아세토니트릴/Milli-Q 물(v/v)이 담긴 균질화 튜브에 넣고, 냉각 조건하에서 조직 균질기를 사용하여 1500 rpm에서 120초간 2회 균질화하였다. 원심분리(2300×g, 4 °C, 5분) 후, 상등액을 Millipore 5-kDa 컷오프 필터(UltrafreeMC-PLHCC)를 이용해 원심여과하였다. 이어서 원심분리(9100×g, 4 °C, 120분)를 시행한 후 초여과를 수행하고, 여과액은 건조시켰다. 건조된 잔류물은 Milli-Q 물에 용해하여 모세관 전기영동 비행시간 질량분석(capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry, CE-TOFMS) 분석에 사용하였다 [17].
양이온 대사체의 측정은 Agilent CE-TOFMS 시스템(Agilent Technologies Inc., CA, USA) No. 13 장비를 이용하여, 퓨즈드 실리카 모세관(내경 50 μm, 총 길이 80 cm)에 연결해 양이온 모드에서 수행하였다. 음이온 대사체의 측정은 Agilent CE-TOFMS 시스템(Agilent Technologies) No. 7 장비를 이용해, 동일한 규격의 퓨즈드 실리카 모세관에 연결하여 음이온 모드에서 수행하였다.
Metabolome analysis
대사체 분석은 Human Metabolome Technologies (HMT, Yamagata, Japan)의 Basic Scan 패키지를 사용하여 수행하였다. CE-TOFMS로 검출된 피크는 자동 통합 소프트웨어 MasterHands™ ver. 2.19.0.2 [18]를 이용해 신호 대 잡음비(signal/noise ratio) ≥ 3을 기준으로 자동 추출되었으며, 피크 면적값, 질량/전하비(m/z), 이동 시간(migration time, MT) 등의 피크 정보를 얻었다. 획득한 피크 면적값은 상대 면적으로 변환하였다. 이 데이터에는 Na⁺, K⁺와 같은 부가 이온(adduct ions)과 탈수 및 암모늄 손실로 인한 단편 이온(fragment ions)이 포함되어 있었으므로, 이러한 질량 관련 이온들은 제거하였다. 남은 피크들은 m/z와 MT 값을 기반으로 HMT 대사체 라이브러리에 따라 주석(annotation)되었다.
Visualization of gastric microbiota signatures and tissue metabotypes by non‑negative matrix factorization
비음행렬분해(Non-negative matrix factorization)는 이전에 보고된 방법에 따라 수행하였다 [19]. 위 미생물 시그니처(GMS) (Supplementary Materials 1–3)와 조직 대사형(tissue metabotypes)의 최적 개수 및 정규화 비율은 3×3 bicross validation을 10회 반복한 결과를 집계하여 결정하였다 [19]. 16S rRNA 시퀀싱의 정렬과 분류에는 각각 Silva reference (v132)와 Greengenes2 데이터베이스가 사용되었다 [20,21]. 거짓발견율(false discovery rate, FDR) < 0.05이면서 절대 효과크기(absolute effect size) ≥ 1인 미생물 분류군과 대사체를 선별하였으며, 데이터는 R 패키지 ggplot과 ggalign을 사용해 히트맵으로 시각화하였다. 방사형 플롯(radial plots)과 유출도(alluvial diagram)는 각각 R 패키지 volcano3D와 ggalluvial을 이용해 작성하였다.
Statistical analysis
연속형 변수는 두 그룹 간 비교에 Wilcoxon 순위합 검정을, 세 그룹 간 비교에는 Kruskal–Wallis 검정을 사용하였으며, 사후 비교는 Dunn의 다중비교검정을 적용하였다. 범주형 변수는 Pearson의 카이제곱 검정 또는 Fisher의 정확 검정을 적절히 사용하여 평가하였다.
미생물군 분석을 위해 시퀀싱 데이터는 생물정보학 파이프라인인 Mothur (https://mothur.org/) [22]와 QIIME2 (https://qiime2.org/) [23]를 사용해 처리하였다. 그룹 중심값 간의 차이는 R 패키지 vegan에 구현된 PERMANOVA(permutational multivariate analysis of variance)를 이용해 평가하였다.
대사체 분석에서는 두 그룹 간 비교를 위해 Welch의 t 검정과 단순 선형 회귀분석을 수행하였다. 모든 통계 분석은 R 소프트웨어(Version 4.3.1, The R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria)를 사용하였다. 통계적 유의성은 p < 0.05로 정의하였으며, p 값은 Benjamini–Hochberg 방법으로 보정하였다.
Results
Baseline characteristics of patients
연령과 성별에서는 대조군, NET 음성군, NET 양성군 간에 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 벽세포항체(antiparietal cell antibody) 양성률과 고가스트린혈증(≥ 3000 pg/mL)은 NET 음성군과 NET 양성군 모두에서 대조군에 비해 유의하게 높았고, 펩시노겐 I/II 비율은 유의하게 낮았다. NET 음성군과 NET 양성군을 비교했을 때, 고가스트린혈증(≥ 3000 pg/mL)은 NET 양성군에서 더 흔히 관찰되었으나(85.7% vs. 50.0%), 통계적으로 유의하지 않았다 (Table 1).
Upper gastrointestinal endoscopic and histopathological f indings of the background gastric mucosa
자가면역성 위염(AIG)과 관련된 상부위장관 내시경의 특징적인 소견으로는 역위축(reverse atrophy), 산분비 점막(oxyntic mucosa) 잔존, 가성용종(pseudopolyps), 끈적하게 달라붙은 점액, 산재한 작은 백색 융기 등이 있다. 역위축, 산분비 점막 잔존, 가성용종, 끈적하게 달라붙은 점액, ECL 세포 과형성의 유병률은 AIG가 있는 NET 음성군과 NET 양성군 모두에서 대조군에 비해 유의하게 높았다. NET 음성군과 NET 양성군을 비교했을 때, 산분비 점막 잔존과 가성용종은 NET 양성군에서 더 흔히 관찰되었으나(각각 85.7% vs. 50.0%, 100.0% vs. 58.3%), 이러한 내시경 소견의 전반적인 빈도에서는 유의한 차이가 없었다. Updated Sydney system을 이용하여 위점막 생검 조직의 병리학적 소견을 평가한 결과, NET 음성군은 NET 양성군에 비해 체부 대만(greater curvature of the corpus)에서 장상피화생의 정도가 유의하게 더 높았다(p = 0.019). ECL 세포 과형성의 양성률은 NET 양성군에서 NET 음성군보다 높았으나(71.4% vs. 50.0%), 이 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(Supplementary Material 4).
Characteristics of neuroendocrine tumor lesions occurring in patients with autoimmune gastritis
총 12개의 NET이 있었으며, 종양의 중앙값 크기는 5.5 mm였고 사분위 범위는 4.5–6.0 mm였다. NET의 절반은 위체부 상부에 위치하였다. 내시경에서 NET은 점막 심부층에서 기원한 점막하 종양(subepithelial tumor)으로 관찰되었다. 세계보건기구(WHO) 분류에 따르면, 모든 NET은 분화도가 좋은 1등급(grade 1) NET이었다(Supplementary Material 5).
Alterations in α‑diversity of gastric mucosa‑associated microbiota at the level of 16S rRNA gene operational taxonomic units
α-다양성 지표 중 비모수적 Shannon index는 대조군에 비해 AIG가 있는 NET 음성군과 NET 양성군 모두에서 유의하게 낮았다(control vs. NET 음성군, p = 0.002, FDR = 0.022; control vs. NET 양성군, p = 0.012, FDR = 0.094) (Fig. 1a). 마찬가지로 Inverse Simpson index도 대조군에 비해 AIG가 있는 NET 음성군과 NET 양성군 모두에서 유의하게 감소하였다(control vs. NET 음성군, p < 0.001, FDR = 0.007; control vs. NET 양성군, p = 0.003, FDR = 0.037) (Fig. 1b). 비모수적 Shannon index, Inverse Simpson index, Chao1 richness를 포함한 α-다양성 지표들은 NET 양성군에서 변동성이 낮고 더 압축된 분포를 보였다(Fig. 1a–c). 동일 군 내에서 생검 채취 부위 간에는 α-다양성 지표에서 유의한 차이가 없었다(Fig. 1d–f).
Fig. 1 Alterations in α-diversity of gastric mucosa-associated microbiota at the level of 16S rRNA gene operational taxonomic units. a Nonparametric Shannon index, b inverse Simpson index, c Chao1 richness, d nonparametric Shannon index by biopsy site, e inverse Simpson index by biopsy site, f Chao1 richness by biopsy site. NET−, neuroendocrine tumor (NET)-negative group; NET+, NET positive group; A1, Greater curvature of antrum; A2, Lesser curvature of angulus; B1, Lesser curvature of corpus; B2, Greater curvature of corpus; *p < 0.05; **p < 0.01
Alterations in β‑diversity of gastric mucosa‑associated microbiota at the level of 16S rRNA gene operational taxonomic units
β-다양성 분석에서, unweighted UniFrac distance를 기반으로 한 PERMANOVA 결과 NET 진단이 배경 요인 중 미생물 군집 변이의 주요 결정인자임이 밝혀졌다(R² = 0.023, p = 0.001, FDR = 0.005) (Fig. 2a). 주좌표분석(PCoA) 도표에서도 대조군, NET 음성군, NET 양성군 간에 미생물 군집 구성이 유의하게 분리되는 양상이 확인되었다(Fig. 2b). 반면, 동일 군 내에서 생검 채취 부위 간에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다(R² = 0.022, p = 0.875, FDR = 0.875) (Fig. 2c).
마찬가지로, weighted UniFrac distance를 기반으로 한 PERMANOVA에서도 NET 진단이 조사된 배경 요인 중 β-다양성의 가장 큰 분산을 설명하였다(R² = 0.039, p = 0.001, FDR = 0.005) (Fig. 2d). 해당 PCoA 도표 또한 대조군, NET 음성군, NET 양성군 간 미생물 군집 구성의 유의한 분리를 보여주었다(Fig. 2e). unweighted UniFrac 분석과 유사하게, 동일 군 내 생검 채취 부위 간에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다(R² = 0.020, p = 0.697, FDR = 0.714) (Fig. 2f).
Fig. 2 Alterations in β-diversity of gastric mucosa-associated microbiota at the level of 16S rRNA gene operational taxonomic units. a Permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA) based on unweighted UniFrac distance to assess the impact of factors on microbial community variation, b Principal coordinate analy sis (PCoA) plot based on unweighted UniFrac distance by neuroen docrine tumor (NET) diagnosis, c PCoA plot based on unweighted UniFrac distance by biopsy site, d PERMANOVA based on weighted UniFrac distance to assess the impact of factors on microbial community variation, e PCoA plot based on weighted UniFrac distance by NET diagnosis, f PCoA plot based on weighted UniFrac distance by biopsy site. BMI, body mass index; TPO, thyroid peroxidase; ECL, enterochromaffin-like; H. pylori, Helicobacter pylori; CL, control group; N−, NET-negative group; N+, NET-positive group; A1, Greater curvature of antrum; A2, Lesser curvature of angulus; B1, Lesser curvature of corpus; B2, Greater curvature of corpus; *p < 0.05; **p < 0.01
Comparative relative abundance analysis of changes in gastric mucosa‑associated microbial taxa
분류학적 풍부도 분석 결과, 문(phylum) 수준에서 NET 양성군은 NET 음성군에 비해 Proteobacteria의 비율이 유의하게 높았고(25.0% vs. 17.7%, p = 0.001), Fusobacteriota의 비율도 더 높았으며(6.1% vs. 2.9%, p < 0.001), Firmicutes의 비율은 더 낮았다(38.8% vs. 49.2%, p < 0.001).
Proteobacteria, Fusobacteriota, Firmicutes 세 문 중, 속(genus) 수준에서 NET 양성군은 Neisseria(16.06% vs. 6.93%, p = 0.007)와 Fusobacterium(4.10% vs. 1.46%, p < 0.001)의 비율이 유의하게 더 높았고, Veillonella(4.31% vs. 6.61%, p = 0.002)와 Lactobacillus(0.56% vs. 2.39%, p = 0.026)의 비율은 더 낮았다.
상대적 풍부도가 높은 주요 세균 종(species) 중에서 NET 양성군은 Proteobacteria 문에 속하는 Haemophilus parainfluenzae(2.32% vs. 2.07%, p = 0.011)와, Fusobacteriota 문에 속하는 Fusobacterium periodonticum(3.01% vs. 0.82%, p < 0.001), Fusobacterium nucleatum(0.25% vs. 0.14%, p = 0.002)이 유의하게 증가하였다. 반대로, Firmicutes 문에 속하는 Streptococcus salivarius(2.64% vs. 7.86%, p < 0.001)와 Veillonella atypica(1.56% vs. 2.53%, p = 0.003)는 유의하게 감소하였다.
위 점막 관련 미생물 군집의 풍부도 비교 분석 결과를 나타낸 그래프는 Supplementary Material 6에 제시되었다. 위 점막 관련 미생물 군집의 상대적 풍부도 데이터와 변화(미분류 종을 제외한 상위 50종)는 Table 2에 제시되어 있다.
Supplementrary material 6. Comparative relative abundance analysis of gastric mucosa-associated microbiota taxa
(a) Phylum-level composition of gastric mucosa-associated microbiota, (b) Genus-level composition of gastric mucosa-associated microbiota, (c) Species-level composition of gastric mucosa-associated microbiota (top 50 species after removal of unassigned organisms)
Pathway‑level changes in host tissue‑derived metabolites
CE-TOFMS를 이용한 대사체 분석에서 HMT 대사체 라이브러리에 등록된 m/z 및 MT 값을 기준으로 총 378개의 피크(양이온 221개, 음이온 157개)가 검출되었다. 대조군과 NET 음성군 간 비교 분석에서 유의한 차이를 보인 대사체(p < 0.05 및 비율 > 1.5배 또는 < 0.67배)와 해당 대사 경로는 Table 3에 제시하였다. AIG 환자의 NET 음성군에서는 대조군에 비해 포도당 대사(해당과정, glycolysis), 트라이카복실산(TCA) 대사, 그리고 코엔자임 대사 관련 대사체는 감소한 반면, 포도당 대사(변형), 글루타메이트 대사, 콜린 대사, 트립토판 대사, 핵산 대사와 관련된 대사체는 증가하였다.
Identification of gastric microbiota signatures and tissue metabotypes by non‑negative matrix factorization
위 점막 관련 미생물의 상대적 풍부도를 히트맵으로 시각화한 결과, NET 양성군은 대조군 및 NET 음성군과 비교했을 때 뚜렷하게 구별되는 조성 패턴을 보였으며, NET 양성군에서는 GMS6가 우세하게 나타났다(Fig. 3a). 숙주 조직 유래 대사체 프로파일 분석에서는 AIG 환자의 NET 음성군과 NET 양성군이 유사한 대사체 구성을 공유하는 반면, 대조군과 AIG 환자 간에는 대사체 구성이 달라지는 양상이 확인되었다. 대조군에서는 조직 대사형 B가 특이적으로 나타났으며, AIG 환자에서는 조직 대사형 A가 주로 관찰되었다(Fig. 3b). 방사형 플롯 분석에서는 특정 미생물 분류군의 상대적 풍부도가 대조군 및 NET 음성군에 비해 NET 양성군 쪽으로 이동하는 경향을 보여주었다(Fig. 3c). 또한 AIG 환자와 대조군 사이에는 숙주 조직 유래 대사체의 상대적 풍부도에서 체계적인 차이가 존재하였다(Fig. 3d).
Fig. 3 Identification of gastric microbiota signatures and tissue metabotypes by non-negative matrix factorization. a Heatmap visu alization of the relative abundance of gastric mucosa-associated microbiota. b Heatmap visualization of the relative abundance (rela tive area under the peak) of host tissue-derived metabolites. Rows are microbial taxa or metabolite features, sorted by k-means clustering; columns represent individual microbiome samples or metabolic pro f iles, sorted by nested hierarchical ward D2 clustering. c Radial plots of shifts in the relative abundance of operational taxonomic units. d Radial plots of shifts in the relative abundance (relative area under the peak) of host tissue-derived metabolites. Axis values represent z-scores. NET, neuroendocrine tumor; GMS, gastric microbiota sig natures; A1, Greater curvature of antrum; A2, Lesser curvature of angulus; B1, Lesser curvature of corpus; B2, Greater curvature of corpus; NET−, NET-negative group; NET+, NET-positive group; NS, not significant; Sig, significant
Integrated analysis of gastric microbiota signatures and tissue metabotypes
위 미생물 시그니처(GMS)와 조직 대사형(tissue metabotype)의 통합 분석을 통해 생성된 올루비얼(alluvial) 다이어그램에서는 GMS, NET 진단, 조직 대사형 간에 유의한 연관성이 나타났다(GMS vs. NET 진단, p = 1 × 10⁻⁶; NET 진단 vs. 조직 대사형, p = 1 × 10⁻⁶; GMS vs. 조직 대사형, p = 4.7 × 10⁻⁵). 특히 GMS6, NET 양성군, 조직 대사형 A 사이, 그리고 NET 음성군과 조직 대사형 A 사이에서 뚜렷한 연결 흐름이 관찰되었다(Fig. 4).
Fig. 4 Integrated analysis of gastric microbiota signatures and tissue metabotypes. Alluvial diagram summarizing the relative frequency relation ships among gastric microbiota signature, NET diagnosis, and tissue metabotypes. Grey, dark grey and black lines correspond to the control, NET-negative, and NET-positive groups, respectively. GMS, gastric microbiota signatures; NET, neuroendocrine tumor; NET−, NET-negative group; NET+, NET-positive group
Discussion
이 연구에서는 자가면역성 위염(AIG) 환자에서 위 신경내분비종양(NET)이 발생한 경우, 위 점막 관련 미생물군집(microbiota) 프로파일의 변화를 관찰하였다. 이는 지금까지 탐구되지 않았던 관점에서 AIG 병태생리에 대한 이해를 확장시켜 준다. 미생물 다양성 지표 중 α-다양성 지표인 비모수적 Shannon index와 Inverse Simpson index는 AIG 환자의 위 점막 관련 미생물군집에서 유의하게 감소하였다. 이러한 결과는 정상 위의 미생물군집이 AIG 환자에 비해 Pielou’s evenness, 종 풍부도(species richness), Simpson index가 유의하게 높았음을 보고한 이전 연구 결과와 일치한다[10]. 이러한 감소는 AIG 환자에서 미생물 다양성이 낮음을 의미하며, 이는 위장관 종양을 포함한 질환 상태와 낮은 미생물 다양성을 연관지은 기존 연구들과도 일치한다[24–26]. 또한 NET 양성군에서 변동성이 낮고 더 압축된 분포를 보였다는 점은 보다 균일한 미생물 조성이 존재함을 시사하며, 이는 NET 형성에 기여할 수 있다. Unweighted 및 weighted UniFrac distance를 활용한 β-다양성 분석에서도 AIG 및 NET 상태가 뚜렷하게 구별되는 미생물 조성과 연관되어 있음이 확인되었다.
세균 군집의 히트맵에서는 NET 양성군에서 Proteobacteria와 Fusobacteriota가 증가된 특징적인 미생물 프로파일이 확인되었다. Proteobacteria는 사람에게 다양한 질병을 일으키는 병원성 균주를 포함하는 그람음성 세균군이다[27]. 이전 연구에서는 Haemophilus parainfluenzae가 크론병[28] 및 비소세포폐암[29]과 연관되어 있음이 보고되었다. Fusobacteriota는 혐기성 그람음성 세균으로 구강과 위장관 미생물군집의 중요한 구성 요소이다. Fusobacterium periodonticum과 Fusobacterium nucleatum은 염증을 촉진하고 병원성을 유발하는 것으로 알려져 있다. Fusobacterium periodonticum은 식도암[30] 및 구강암[31]과 연관이 있으며, Fusobacterium nucleatum은 궤양성 대장염[32], 대장암 진행[33,34], 구강암[35]과 관련이 있다. 반대로, NET 양성군에서는 Firmicutes가 감소하였다. Firmicutes는 인체 건강 유지에 중요한 유익한 종을 다수 포함하는 그람양성 세균군이다. Streptococcus salivarius는 항염증 효과가 보고되었으며[36], 이 균주가 생산하는 salivaricins는 구강 병원균의 성장을 억제한다[37]. 또한 Veillonella atypica는 생쥐에서 러닝머신 운동 시간을 늘리고 염증성 사이토카인을 감소시키는 것으로 보고되었으며[38], 인간에서도 운동 능력을 유지하는 프로바이오틱스로 관찰되었다[39].
이러한 위 점막 관련 미생물군집의 변화는 미생물 불균형(dysbiosis)이 AIG 환자에서 위 NET 형성에 기여할 수 있음을 시사한다. 본 연구에서 고가스트린혈증과 ECL 세포 과형성은 NET 양성군에서 더 흔히 관찰되었으나 통계적으로 유의하지는 않았다. 그러나 이 요인들이 특정 세균 집단의 비율 변화에 잠재적으로 영향을 미쳤을 가능성이 있다.
AIG와 연관된 위 NET은 대개 위저선(fundic gland) 영역, 특히 위체부와 위저부에서 발생하며[40], 이는 AIG에서 관찰되는 위 점막 위축 부위와 일치한다. 본 연구에서도 NET 병변의 91.7%가 위체부 또는 위저부에 위치하였다. 점막 생검의 조직병리학적 평가 결과, 위체부 대만(greater curvature)의 장상피화생 정도는 NET 양성군에서 NET 음성군보다 낮았다. NET 환자의 사례 수가 제한적이기는 하지만, 이는 AIG와 관련된 NET이 장상피화생이 완전히 확립된 말기 단계 이전, 위염의 진행 단계에서부터 발생할 수 있음을 시사한다. NET의 기원으로 여겨지는 위 내분비 세포 미세군집(micronests)은 점막 내 선관 밖에서 증식하여 군집 구조를 형성하는 내분비 세포 집단이다. 따라서 위 NET은 장상피화생의 정도와는 독립적으로 발생할 수 있다.
미생물군 분석 결과 외에도, 대사체 분석에서는 대사체 피크 측정치의 유의한 변화가 확인되었다. AIG 환자에서는 포도당 대사가 해당과정(glycolysis)에서 다른 경로로 전환되었다. 이러한 전환과 TCA 회로 활성 감소는 에너지 생성 감소로 이어졌다. 그러나 다른 대사 경로가 이를 보상할 수 있으며, 이는 대사 재프로그래밍(metabolic reprogramming)을 시사한다. 이러한 변화는 미토콘드리아 기능 장애, 염증 환경, 위 점막 회복 증가, 후성유전학적 조절 이상 등에 의해 영향을 받을 가능성이 있다.
종합하면, 미생물군 분석에서는 NET 음성군과 NET 양성군 간 유의한 차이가 관찰된 반면, 대사체 분석에서는 대조군과 AIG 환자 간 뚜렷한 차이가 확인되었다. GMS와 조직 대사형의 통합 분석을 통해 생성된 올루비얼 다이어그램에서 특정 조직 대사형과 AIG 간 강한 연관성이 관찰되었으며, 특정 GMS와 NET 양성군 간 강한 연관성은 특정 GMS를 보유한 AIG 환자가 NET 발생 위험이 높을 수 있음을 시사한다. 이는 AIG 환자에서 숙주 조직 유래 대사체 변화가 위 점막 관련 미생물군집의 변화보다 먼저 발생하여, NET 발생에 관여하는 특정 미생물이 증식할 수 있는 미세환경을 조성할 가능성을 제시한다.
본 연구에는 몇 가지 한계가 있다. 첫째, AIG 및 연관된 NET은 일본에서 비교적 드물기 때문에 표본 수가 적었다. 이러한 결과를 검증하기 위해서는 대규모 다기관 연구가 필요하다. 둘째, 16S rRNA 시퀀싱 기법은 본질적으로 기능 및 경로 분석에 한계가 있으며, 세균 생체량이 상대적으로 적고, 대사체가 세균 유래가 아닌 숙주 유래라는 점은 숙주 조직 대사체 분석과 통합할 때 미생물군집 데이터의 해석을 더욱 어렵게 한다. 따라서 미생물군집, 숙주 유래 대사체, NET 간의 상호작용에 대한 인과적 기전을 규명하고, 잠재적인 임상적 적용 가능성을 탐색하기 위한 추가 연구가 필요하다.
결론적으로, 본 연구는 AIG 환자에서 발생한 위 NET과 관련하여 위 점막 미생물군집 프로파일이 뚜렷하게 변화했음을 보여준다. 미생물군 분석은 뚜렷한 미생물 불균형을 확인하였으며, 이는 NET 형성에 기여할 수 있다. 대사체 분석에서는 해당과정의 전환, TCA 회로 활성 감소, 대사 재프로그래밍이 확인되었다. 미생물군과 대사체의 통합 분석은 AIG 환자에서 숙주 대사의 변화가 점막 미생물 불균형에 선행하며, NET 형성을 촉진하는 미세환경을 조성할 수 있음을 시사한다.
<Abstract>
Background: Autoimmune gastritis (AIG) is a chronic atrophic gastritis that affects the gastric corpus, leading to achlorhydria, hypergastrinemia, and a precursor of neuroendocrine tumors (NETs). This study aimed to elucidate the underlying mechanisms of gastric NET formation in AIG by analyzing gastric mucosa-associated microbiota and host tissue-derived metabolite profiles.
Methods: A total of 19 patients diagnosed with AIG and 12 controls uninfected with Helicobacter pylori underwent gastric mucosal biopsies for microbiome analysis using next-generation sequencing with primers targeting the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, and metabolome analysis using capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry.
Results: Microbiome analysis revealed significantly reduced α-diversity indices in patients with AIG when compared with the control group. β-Diversity analysis showed distinct microbial compositions among the control, NET-negative, and NET-positive groups. The NET-positive group exhibited a significantly higher abundance of Proteobacteria and Fusobacteriota, particularly Haemophilus parainfluenzae, Fusobacterium periodonticum, and Fusobacterium nucleatum, whereas Firmicutes, including Streptococcus salivarius and Veillonella atypica, were significantly decreased compared with the NET-negative group. Metabolome analysis revealed a shift away from glycolysis and tricarboxylic acid cycle activity toward alternative metabolic pathways in patients with AIG. Integrated analysis of gastric microbiota signatures (GMS) and tissue metabotypes demonstrated significant associations among GMS, tissue metabotypes, and NET diagnosis.
Conclusions: These findings highlight marked shifts in gastric mucosa-associated microbiota profiles in patients with AIG who developed gastric NETs. Tissue-specific metabolic alterations may precede mucosal dysbiosis in patients with AIG and promote the development of a microenvironment implicated in NET formation.
Keywords: Autoimmune gastritis; Dysbiosis; Gastric microbiota; Metabolomics; Neuroendocrine tumors.
배경
자가면역성 위염(AIG)은 위체부를 침범하는 만성 위축성 위염으로, 무산증(achlorhydria)과 고가스트린혈증(hypergastrinemia)을 유발하며 신경내분비종양(NETs)의 전구 병변으로 알려져 있다. 본 연구는 AIG 환자에서 위 점막 연관 미생물총(microbiota)과 숙주 조직 유래 대사체 프로파일을 분석하여 위 NET 발생의 기전을 규명하는 것을 목표로 하였다.
방법
AIG로 진단된 환자 19명과 헬리코박터 파일로리(H. pylori)에 감염되지 않은 대조군 12명을 대상으로 위 점막 생검을 시행하였다. 미생물군 분석은 16S rRNA 유전자의 V3–V4 영역을 표적하는 프라이머를 이용한 차세대염기서열분석(next-generation sequencing)으로 수행되었으며, 대사체 분석은 모세관 전기영동 비행시간 질량분석(capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry)을 통해 수행되었다.
결과
미생물군 분석에서 AIG 환자는 대조군에 비해 유의하게 감소된 α-다양성 지수를 보였다. β-다양성 분석에서는 대조군, NET 음성군, NET 양성군 간에 뚜렷이 구분되는 미생물 조성이 나타났다. NET 양성군에서는 Proteobacteria와 Fusobacteriota가 유의하게 증가하였으며, 특히 Haemophilus parainfluenzae, Fusobacterium periodonticum, Fusobacterium nucleatum이 두드러졌다. 반면, NET 음성군에 비해 Streptococcus salivarius와 Veillonella atypica를 포함한 Firmicutes는 유의하게 감소하였다. 대사체 분석에서는 AIG 환자에서 해당과정(glycolysis) 및 TCA 회로(tricarboxylic acid cycle) 활성이 감소하고 대체 대사 경로로 전환되는 양상이 관찰되었다. 위 미생물 시그니처(GMS)와 조직 대사체 유형을 통합 분석한 결과, GMS, 조직 대사체, NET 진단 간에 유의한 연관성이 확인되었다.
결론
이번 연구는 AIG 환자에서 위 NET이 발생한 경우 위 점막 연관 미생물총 프로파일에 뚜렷한 변화를 보임을 보여주었다. 또한, 조직 특이적 대사 변화가 점막의 이생균총(dysbiosis)에 선행하여 NET 발생과 관련된 미세환경 조성에 기여할 수 있음을 시사한다.
Otani K, Nakatsu G, Fujimoto K, Miyaoka D, Sato N, Nadatani Y, Nishida Y, Maruyama H, Ominami M, Fukunaga S, Hosomi S, Tanaka F, Imoto S, Uematsu S, Watanabe T, Fujiwara Y.
J Gastroenterol. 2025 Sep 11. doi: 10.1007/s00535-025-02298-w.
* 알파다양성: 미생물 무리 자체의 다양성 (얼마나 많은 수의 미생물이 있는지 (richness)와 얼마나 고르게 분포되어 있는지 (evenness))
* 베타다양성: 미생물 무리 구성이 대조군의 미생물 무리 구성과 어떻게 다른가에 대한 내용 (상대적인 값)
Introduction
자가면역성 위염(AIG)은 위체부의 만성 위축성 위염을 특징으로 하며, 위벽세포에 대한 자가항체에 의해 면역 매개적으로 위벽세포가 파괴되어 무산증(achlorhydria)과 고가스트린혈증(hypergastrinemia)이 발생한다 [1]. 일본소화기내시경학회 산하 연구회에서는 AIG의 진행 단계 진단 기준을 제안하였는데, 여기에는 AIG를 시사하는 내시경 또는 조직학적 소견과 위벽세포 항체 혹은 내인자 항체의 존재가 포함된다. AIG 연구위원회는 역위축(reverse atrophy) 양상 외에도 산분비 점막의 잔존(remnants of oxyntic mucosa), 끈적하고 조밀하게 부착된 점액(sticky adherent dense mucus), 산재된 작은 백색 돌기(scattered minute whitish protrusions) 등 AIG의 여러 내시경적 특징을 제시하였다 [2]. 최근 수년간 AIG의 진단 기준과 내시경 소견이 점차 규명되면서, 이 질환에 대한 관심과 주목이 크게 증가하였다.
AIG의 진단적 의의는 AIG의 가장 어려운 합병증 중 하나인 위 신경내분비종양(NETs) 발생의 고위험군을 평가하는 데 있다. 위 NETs의 분류에는 Rindi 분류가 널리 사용되며, AIG는 제1형(type I) NETs의 전구 병변이다 [3]. AIG 환자에서 위 NETs의 발생률은 0.7~15.4%로 보고되어 있다 [4]. 고가스트린혈증은 AIG에서 위 NETs와 연관이 있으며 [5], 위 점막의 ECL(enterochromaffin-like) 세포 증식을 자극하여 위 NETs 발생 위험을 높이는 것으로 알려져 있다 [6]. 그러나 AIG 환자에서 위 NETs 형성에 관여하는 병태생리학적 세부 기전은 여전히 잘 밝혀지지 않았다.
위는 강한 산성 환경을 갖기 때문에, 오랫동안 요소분해효소를 생성하는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)를 제외한 대부분의 세균에게는 불리한 환경으로 여겨져 왔다. H. pylori는 위암의 주요 위험인자이다 [7]. 그러나 분자생물학적 분석에 따르면 Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteriota, Bacteroidota, Fusobacteriota 등 다양한 세균이 인간 위 미생물총을 구성하는 것으로 밝혀졌다 [8]. 이전 연구에서는 위 점막 연관 미생물총의 다양성이나 구성이 변형되는 이생균총(dysbiosis)이 H. pylori 제균 치료 후에도 지속되며, 이는 이시성 위암(metachronous gastric cancer)의 발생에 기여한다는 사실을 보여주었다 [9]. 또한 AIG에서도 무산증에 의해 위 점막 연관 미생물총의 이생균총이 관찰되며, AIG는 H. pylori 유발 위축성 위염과는 다른 미생물 프로파일을 보이는 것으로 보고되었다 [10].
위장을 넘어 위장관(GI tract)의 미생물총은 염증성 장질환을 포함한 여러 자가면역질환과 관련이 있다고 알려져 있다 [11,12]. 또한, GI 미생물총과 선암종(adenocarcinoma)의 연관성을 조사한 연구는 존재하지만 [13], GI 미생물총과 NETs 간의 관계를 살펴본 연구는 매우 드물다. 더 나아가 NETs와 대사 경로 간의 관계는 NET 환자의 혈장 대사체 분석을 통해 연구된 바 있다 [14]. 그러나 AIG 환자에서 대사 경로의 변화를 다룬 보고는 현재까지 없다.
따라서 본 연구에서는 위 조직의 미생물총과 대사 프로파일 변화를 분석하고, 이들이 AIG의 병태생리 및 위 NETs 형성에 기여할 가능성을 조사하였다.
Methods
Study design
This was a single-center, observational study.
Study population
총 19명의 AIG 환자와 H. pylori에 감염되지 않았고 AIG가 없는 대조군 12명이 연속적으로 등록되었다. 19명의 AIG 환자 중, 병리조직학적 검사에서 위 NET이 발생한 7명은 NET 양성군으로 분류하였고, 위 NET이 발생하지 않은 12명은 NET 음성군으로 분류하였다.
Eligibility criteria of the study population
포함 기준은 다음과 같다. 2020년 10월부터 2023년 2월 사이 오사카 시립대학병원에서 연구 참여에 동의한 만 18세 이상의 환자 중, 아래에 기술된 AIG 진단 기준에 따라 AIG로 확진된 환자를 연속적으로 AIG군에 등록하였다. 대조군은 내시경 평가에서 H. pylori에 감염되지 않았으며, 제균 치료 병력이 없고, 항–H. pylori 항체 혈청검사, 병리조직학적 검사, 또는 대변 H. pylori 항원검사를 통해 H. pylori 음성으로 확인된 환자 중에서 AIG 환자와 연령(±10세)과 성별을 매칭하여 등록하였다.
제외 기준은 다음과 같다. 연구 참여에 동의하지 않았거나, 연락 후 참여를 거부한 환자는 제외하였다.
Diagnostic criteria for autoimmune gastritis
본 연구에서 AIG는 위벽세포 항체 또는 내인자 항체의 존재, 상부 위장관 내시경에서 관찰된 위체부의 광범위한 위축, 그리고 24시간 임피던스-pH 모니터링을 통해 확인된 무산증을 근거로 진단하였다.
Outcome measurement
이 연구의 주된 목적은 위 NET 동반 여부에 따른 AIG 환자에서 위 점막 연관 미생물총과 숙주 조직 유래 대사체 프로파일의 변화를 조사하고, AIG에서 위 NET 형성의 근본적인 기전을 규명하는 것이었다.
Sample collection
위 점막 생검 검체는 상부 위장관 내시경 동안 모든 참가자에게서 미리 정의된 네 부위에서 채취하였다: 전정부 대만(A1), 위각 소만(A2), 체부 소만(B1), 체부 대만(B2). 채취된 검체는 미생물군 및 대사체 분석을 위해 즉시 냉동 보관하였다.
Medications
환자들은 AIG 진단을 위한 24시간 임피던스-pH 모니터링 시행 2주 전부터 위산 억제제를 중단하였다. 무산증이 확인되고 AIG가 진단된 이후에는 어떤 위산 억제제도 처방되지 않았으며, 미생물군 및 대사체 분석을 위한 위 점막 생검 시점에도 이러한 약물을 복용하지 않았다. 대조군 환자들 또한 위 점막 생검 시행 2주 전부터 위산 억제 치료를 중단하였다. 규칙적으로 항생제 치료를 받고 있는 환자는 본 연구에 포함되지 않았다.
DNA extraction for microbiome analysis
위 점막 생검 검체는 10× Tris–EDTA (TE) 완충용액이 담긴 마이크로 원심분리 튜브에 넣었다. 이후 라이소자임 용액(계란 흰자 유래 Lysozyme; Merck KGaA, Darmstadt, Germany)을 첨가하고 37 °C에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어서 아크로모펩티다제(Achromopeptidase, Purified, Lytic Enzyme [TBL-1]; FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp., Osaka, Japan)를 첨가하고 37 °C에서 30분간 반응시켰다. 그 다음 Proteinase K (Tritirachium album 유래; Merck)와 20% Sodium Dodecyl Sulfate 용액(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.)을 첨가한 후, 혼합물을 55 °C에서 1시간 동안 반응시켰다.
Phenol–chloroform 추출은 UltraPure™ Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) (Thermo Fisher Scientific, Inc., MA, USA)을 첨가한 후 원심분리하여 수행하였다. 수상층은 새로운 튜브로 옮긴 뒤 3 M sodium acetate(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.)와 isopropanol을 첨가하였다. 원심분리 후 생성된 펠릿을 75% 에탄올로 세척하고 다시 원심분리한 뒤 공기 중에서 건조하였다.
펠릿은 Ribonuclease (DNase free) Glycerol Solution (Nippon Gene Co., Ltd., Tokyo, Japan)이 포함된 1× TE 완충용액에 재부현(resuspension)하여 37 °C에서 30분간 반응시켰다. DNA는 추가적으로 20% polyethylene glycol 용액(50% w/v Polyethylene glycol 6000; Hampton Research Corp., CA, USA)을 첨가한 뒤 원심분리하여 정제하였다. 최종적으로 생성된 펠릿은 75% 에탄올로 세척 후 원심분리하고 건조한 뒤, 0.5× TE 완충용액에 다시 부현하였다.
Microbiome analysis
16S rRNA 유전자의 V3–V4 영역 시퀀스는 이전에 보고된 방법에 따라 준비하였다 [15,16]. 간단히 말해, V3와 V4 영역을 포함한 16S rRNA 유전자 절편은 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 증폭하였다(Forward primer: ACA CGA CGC TCT TCC GAT CTC CTA CGGGNGGC WGC AG; Reverse primer: GAC GTG TGC TCT TCC GAT CTG ACT ACHVGGG TAT CTA ATC C). PCR은 20~30 사이클 동안 수행하였으며, 생성된 PCR 산물은 Agencourt AMPure beads(Beckman Coulter)를 사용해 정제하였다.
다음으로, 시퀀싱을 위해 NEBNext Multiplex Oligos for Illumina(Dual Index Primers Set1, New England Biolabs)를 이용해 8 사이클 동안 두 번째 PCR을 수행하여 인덱스 서열을 부가하였다. 이 산물 역시 Agencourt AMPure beads로 정제하였다.
각 샘플에서 동일한 양의 DNA 앰플리콘 라이브러리를 혼합한 뒤, MiSeq 장비(Illumina)에서 MiSeq v3 Reagent kit와 15% PhiX를 사용하여 시퀀싱을 수행하였다.
Sample preparation for metabolome analysis
위 점막 생검 조직 검체는 내부 표준물이 포함된 50% 아세토니트릴/Milli-Q 물(v/v)이 담긴 균질화 튜브에 넣고, 냉각 조건하에서 조직 균질기를 사용하여 1500 rpm에서 120초간 2회 균질화하였다. 원심분리(2300×g, 4 °C, 5분) 후, 상등액을 Millipore 5-kDa 컷오프 필터(UltrafreeMC-PLHCC)를 이용해 원심여과하였다. 이어서 원심분리(9100×g, 4 °C, 120분)를 시행한 후 초여과를 수행하고, 여과액은 건조시켰다. 건조된 잔류물은 Milli-Q 물에 용해하여 모세관 전기영동 비행시간 질량분석(capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry, CE-TOFMS) 분석에 사용하였다 [17].
양이온 대사체의 측정은 Agilent CE-TOFMS 시스템(Agilent Technologies Inc., CA, USA) No. 13 장비를 이용하여, 퓨즈드 실리카 모세관(내경 50 μm, 총 길이 80 cm)에 연결해 양이온 모드에서 수행하였다. 음이온 대사체의 측정은 Agilent CE-TOFMS 시스템(Agilent Technologies) No. 7 장비를 이용해, 동일한 규격의 퓨즈드 실리카 모세관에 연결하여 음이온 모드에서 수행하였다.
Metabolome analysis
대사체 분석은 Human Metabolome Technologies (HMT, Yamagata, Japan)의 Basic Scan 패키지를 사용하여 수행하였다. CE-TOFMS로 검출된 피크는 자동 통합 소프트웨어 MasterHands™ ver. 2.19.0.2 [18]를 이용해 신호 대 잡음비(signal/noise ratio) ≥ 3을 기준으로 자동 추출되었으며, 피크 면적값, 질량/전하비(m/z), 이동 시간(migration time, MT) 등의 피크 정보를 얻었다. 획득한 피크 면적값은 상대 면적으로 변환하였다. 이 데이터에는 Na⁺, K⁺와 같은 부가 이온(adduct ions)과 탈수 및 암모늄 손실로 인한 단편 이온(fragment ions)이 포함되어 있었으므로, 이러한 질량 관련 이온들은 제거하였다. 남은 피크들은 m/z와 MT 값을 기반으로 HMT 대사체 라이브러리에 따라 주석(annotation)되었다.
Visualization of gastric microbiota signatures and tissue metabotypes by non‑negative matrix factorization
비음행렬분해(Non-negative matrix factorization)는 이전에 보고된 방법에 따라 수행하였다 [19]. 위 미생물 시그니처(GMS) (Supplementary Materials 1–3)와 조직 대사형(tissue metabotypes)의 최적 개수 및 정규화 비율은 3×3 bicross validation을 10회 반복한 결과를 집계하여 결정하였다 [19]. 16S rRNA 시퀀싱의 정렬과 분류에는 각각 Silva reference (v132)와 Greengenes2 데이터베이스가 사용되었다 [20,21]. 거짓발견율(false discovery rate, FDR) < 0.05이면서 절대 효과크기(absolute effect size) ≥ 1인 미생물 분류군과 대사체를 선별하였으며, 데이터는 R 패키지 ggplot과 ggalign을 사용해 히트맵으로 시각화하였다. 방사형 플롯(radial plots)과 유출도(alluvial diagram)는 각각 R 패키지 volcano3D와 ggalluvial을 이용해 작성하였다.
Statistical analysis
연속형 변수는 두 그룹 간 비교에 Wilcoxon 순위합 검정을, 세 그룹 간 비교에는 Kruskal–Wallis 검정을 사용하였으며, 사후 비교는 Dunn의 다중비교검정을 적용하였다. 범주형 변수는 Pearson의 카이제곱 검정 또는 Fisher의 정확 검정을 적절히 사용하여 평가하였다.
미생물군 분석을 위해 시퀀싱 데이터는 생물정보학 파이프라인인 Mothur (https://mothur.org/) [22]와 QIIME2 (https://qiime2.org/) [23]를 사용해 처리하였다. 그룹 중심값 간의 차이는 R 패키지 vegan에 구현된 PERMANOVA(permutational multivariate analysis of variance)를 이용해 평가하였다.
대사체 분석에서는 두 그룹 간 비교를 위해 Welch의 t 검정과 단순 선형 회귀분석을 수행하였다. 모든 통계 분석은 R 소프트웨어(Version 4.3.1, The R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria)를 사용하였다. 통계적 유의성은 p < 0.05로 정의하였으며, p 값은 Benjamini–Hochberg 방법으로 보정하였다.
Results
Baseline characteristics of patients
연령과 성별에서는 대조군, NET 음성군, NET 양성군 간에 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 벽세포항체(antiparietal cell antibody) 양성률과 고가스트린혈증(≥ 3000 pg/mL)은 NET 음성군과 NET 양성군 모두에서 대조군에 비해 유의하게 높았고, 펩시노겐 I/II 비율은 유의하게 낮았다. NET 음성군과 NET 양성군을 비교했을 때, 고가스트린혈증(≥ 3000 pg/mL)은 NET 양성군에서 더 흔히 관찰되었으나(85.7% vs. 50.0%), 통계적으로 유의하지 않았다 (Table 1).
Upper gastrointestinal endoscopic and histopathological f indings of the background gastric mucosa
자가면역성 위염(AIG)과 관련된 상부위장관 내시경의 특징적인 소견으로는 역위축(reverse atrophy), 산분비 점막(oxyntic mucosa) 잔존, 가성용종(pseudopolyps), 끈적하게 달라붙은 점액, 산재한 작은 백색 융기 등이 있다. 역위축, 산분비 점막 잔존, 가성용종, 끈적하게 달라붙은 점액, ECL 세포 과형성의 유병률은 AIG가 있는 NET 음성군과 NET 양성군 모두에서 대조군에 비해 유의하게 높았다. NET 음성군과 NET 양성군을 비교했을 때, 산분비 점막 잔존과 가성용종은 NET 양성군에서 더 흔히 관찰되었으나(각각 85.7% vs. 50.0%, 100.0% vs. 58.3%), 이러한 내시경 소견의 전반적인 빈도에서는 유의한 차이가 없었다. Updated Sydney system을 이용하여 위점막 생검 조직의 병리학적 소견을 평가한 결과, NET 음성군은 NET 양성군에 비해 체부 대만(greater curvature of the corpus)에서 장상피화생의 정도가 유의하게 더 높았다(p = 0.019). ECL 세포 과형성의 양성률은 NET 양성군에서 NET 음성군보다 높았으나(71.4% vs. 50.0%), 이 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(Supplementary Material 4).
Characteristics of neuroendocrine tumor lesions occurring in patients with autoimmune gastritis
총 12개의 NET이 있었으며, 종양의 중앙값 크기는 5.5 mm였고 사분위 범위는 4.5–6.0 mm였다. NET의 절반은 위체부 상부에 위치하였다. 내시경에서 NET은 점막 심부층에서 기원한 점막하 종양(subepithelial tumor)으로 관찰되었다. 세계보건기구(WHO) 분류에 따르면, 모든 NET은 분화도가 좋은 1등급(grade 1) NET이었다(Supplementary Material 5).
Alterations in α‑diversity of gastric mucosa‑associated microbiota at the level of 16S rRNA gene operational taxonomic units
α-다양성 지표 중 비모수적 Shannon index는 대조군에 비해 AIG가 있는 NET 음성군과 NET 양성군 모두에서 유의하게 낮았다(control vs. NET 음성군, p = 0.002, FDR = 0.022; control vs. NET 양성군, p = 0.012, FDR = 0.094) (Fig. 1a). 마찬가지로 Inverse Simpson index도 대조군에 비해 AIG가 있는 NET 음성군과 NET 양성군 모두에서 유의하게 감소하였다(control vs. NET 음성군, p < 0.001, FDR = 0.007; control vs. NET 양성군, p = 0.003, FDR = 0.037) (Fig. 1b). 비모수적 Shannon index, Inverse Simpson index, Chao1 richness를 포함한 α-다양성 지표들은 NET 양성군에서 변동성이 낮고 더 압축된 분포를 보였다(Fig. 1a–c). 동일 군 내에서 생검 채취 부위 간에는 α-다양성 지표에서 유의한 차이가 없었다(Fig. 1d–f).
Fig. 1 Alterations in α-diversity of gastric mucosa-associated microbiota at the level of 16S rRNA gene operational taxonomic units. a Nonparametric Shannon index, b inverse Simpson index, c Chao1 richness, d nonparametric Shannon index by biopsy site, e inverse Simpson index by biopsy site, f Chao1 richness by biopsy site. NET−, neuroendocrine tumor (NET)-negative group; NET+, NET positive group; A1, Greater curvature of antrum; A2, Lesser curvature of angulus; B1, Lesser curvature of corpus; B2, Greater curvature of corpus; *p < 0.05; **p < 0.01
Alterations in β‑diversity of gastric mucosa‑associated microbiota at the level of 16S rRNA gene operational taxonomic units
β-다양성 분석에서, unweighted UniFrac distance를 기반으로 한 PERMANOVA 결과 NET 진단이 배경 요인 중 미생물 군집 변이의 주요 결정인자임이 밝혀졌다(R² = 0.023, p = 0.001, FDR = 0.005) (Fig. 2a). 주좌표분석(PCoA) 도표에서도 대조군, NET 음성군, NET 양성군 간에 미생물 군집 구성이 유의하게 분리되는 양상이 확인되었다(Fig. 2b). 반면, 동일 군 내에서 생검 채취 부위 간에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다(R² = 0.022, p = 0.875, FDR = 0.875) (Fig. 2c).
마찬가지로, weighted UniFrac distance를 기반으로 한 PERMANOVA에서도 NET 진단이 조사된 배경 요인 중 β-다양성의 가장 큰 분산을 설명하였다(R² = 0.039, p = 0.001, FDR = 0.005) (Fig. 2d). 해당 PCoA 도표 또한 대조군, NET 음성군, NET 양성군 간 미생물 군집 구성의 유의한 분리를 보여주었다(Fig. 2e). unweighted UniFrac 분석과 유사하게, 동일 군 내 생검 채취 부위 간에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다(R² = 0.020, p = 0.697, FDR = 0.714) (Fig. 2f).
Fig. 2 Alterations in β-diversity of gastric mucosa-associated microbiota at the level of 16S rRNA gene operational taxonomic units. a Permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA) based on unweighted UniFrac distance to assess the impact of factors on microbial community variation, b Principal coordinate analy sis (PCoA) plot based on unweighted UniFrac distance by neuroen docrine tumor (NET) diagnosis, c PCoA plot based on unweighted UniFrac distance by biopsy site, d PERMANOVA based on weighted UniFrac distance to assess the impact of factors on microbial community variation, e PCoA plot based on weighted UniFrac distance by NET diagnosis, f PCoA plot based on weighted UniFrac distance by biopsy site. BMI, body mass index; TPO, thyroid peroxidase; ECL, enterochromaffin-like; H. pylori, Helicobacter pylori; CL, control group; N−, NET-negative group; N+, NET-positive group; A1, Greater curvature of antrum; A2, Lesser curvature of angulus; B1, Lesser curvature of corpus; B2, Greater curvature of corpus; *p < 0.05; **p < 0.01
Comparative relative abundance analysis of changes in gastric mucosa‑associated microbial taxa
분류학적 풍부도 분석 결과, 문(phylum) 수준에서 NET 양성군은 NET 음성군에 비해 Proteobacteria의 비율이 유의하게 높았고(25.0% vs. 17.7%, p = 0.001), Fusobacteriota의 비율도 더 높았으며(6.1% vs. 2.9%, p < 0.001), Firmicutes의 비율은 더 낮았다(38.8% vs. 49.2%, p < 0.001).
Proteobacteria, Fusobacteriota, Firmicutes 세 문 중, 속(genus) 수준에서 NET 양성군은 Neisseria(16.06% vs. 6.93%, p = 0.007)와 Fusobacterium(4.10% vs. 1.46%, p < 0.001)의 비율이 유의하게 더 높았고, Veillonella(4.31% vs. 6.61%, p = 0.002)와 Lactobacillus(0.56% vs. 2.39%, p = 0.026)의 비율은 더 낮았다.
상대적 풍부도가 높은 주요 세균 종(species) 중에서 NET 양성군은 Proteobacteria 문에 속하는 Haemophilus parainfluenzae(2.32% vs. 2.07%, p = 0.011)와, Fusobacteriota 문에 속하는 Fusobacterium periodonticum(3.01% vs. 0.82%, p < 0.001), Fusobacterium nucleatum(0.25% vs. 0.14%, p = 0.002)이 유의하게 증가하였다. 반대로, Firmicutes 문에 속하는 Streptococcus salivarius(2.64% vs. 7.86%, p < 0.001)와 Veillonella atypica(1.56% vs. 2.53%, p = 0.003)는 유의하게 감소하였다.
위 점막 관련 미생물 군집의 풍부도 비교 분석 결과를 나타낸 그래프는 Supplementary Material 6에 제시되었다. 위 점막 관련 미생물 군집의 상대적 풍부도 데이터와 변화(미분류 종을 제외한 상위 50종)는 Table 2에 제시되어 있다.
Supplementrary material 6. Comparative relative abundance analysis of gastric mucosa-associated microbiota taxa
(a) Phylum-level composition of gastric mucosa-associated microbiota, (b) Genus-level composition of gastric mucosa-associated microbiota, (c) Species-level composition of gastric mucosa-associated microbiota (top 50 species after removal of unassigned organisms)
Pathway‑level changes in host tissue‑derived metabolites
CE-TOFMS를 이용한 대사체 분석에서 HMT 대사체 라이브러리에 등록된 m/z 및 MT 값을 기준으로 총 378개의 피크(양이온 221개, 음이온 157개)가 검출되었다. 대조군과 NET 음성군 간 비교 분석에서 유의한 차이를 보인 대사체(p < 0.05 및 비율 > 1.5배 또는 < 0.67배)와 해당 대사 경로는 Table 3에 제시하였다. AIG 환자의 NET 음성군에서는 대조군에 비해 포도당 대사(해당과정, glycolysis), 트라이카복실산(TCA) 대사, 그리고 코엔자임 대사 관련 대사체는 감소한 반면, 포도당 대사(변형), 글루타메이트 대사, 콜린 대사, 트립토판 대사, 핵산 대사와 관련된 대사체는 증가하였다.
Identification of gastric microbiota signatures and tissue metabotypes by non‑negative matrix factorization
위 점막 관련 미생물의 상대적 풍부도를 히트맵으로 시각화한 결과, NET 양성군은 대조군 및 NET 음성군과 비교했을 때 뚜렷하게 구별되는 조성 패턴을 보였으며, NET 양성군에서는 GMS6가 우세하게 나타났다(Fig. 3a). 숙주 조직 유래 대사체 프로파일 분석에서는 AIG 환자의 NET 음성군과 NET 양성군이 유사한 대사체 구성을 공유하는 반면, 대조군과 AIG 환자 간에는 대사체 구성이 달라지는 양상이 확인되었다. 대조군에서는 조직 대사형 B가 특이적으로 나타났으며, AIG 환자에서는 조직 대사형 A가 주로 관찰되었다(Fig. 3b). 방사형 플롯 분석에서는 특정 미생물 분류군의 상대적 풍부도가 대조군 및 NET 음성군에 비해 NET 양성군 쪽으로 이동하는 경향을 보여주었다(Fig. 3c). 또한 AIG 환자와 대조군 사이에는 숙주 조직 유래 대사체의 상대적 풍부도에서 체계적인 차이가 존재하였다(Fig. 3d).
Fig. 3 Identification of gastric microbiota signatures and tissue metabotypes by non-negative matrix factorization. a Heatmap visu alization of the relative abundance of gastric mucosa-associated microbiota. b Heatmap visualization of the relative abundance (rela tive area under the peak) of host tissue-derived metabolites. Rows are microbial taxa or metabolite features, sorted by k-means clustering; columns represent individual microbiome samples or metabolic pro f iles, sorted by nested hierarchical ward D2 clustering. c Radial plots of shifts in the relative abundance of operational taxonomic units. d Radial plots of shifts in the relative abundance (relative area under the peak) of host tissue-derived metabolites. Axis values represent z-scores. NET, neuroendocrine tumor; GMS, gastric microbiota sig natures; A1, Greater curvature of antrum; A2, Lesser curvature of angulus; B1, Lesser curvature of corpus; B2, Greater curvature of corpus; NET−, NET-negative group; NET+, NET-positive group; NS, not significant; Sig, significant
Integrated analysis of gastric microbiota signatures and tissue metabotypes
위 미생물 시그니처(GMS)와 조직 대사형(tissue metabotype)의 통합 분석을 통해 생성된 올루비얼(alluvial) 다이어그램에서는 GMS, NET 진단, 조직 대사형 간에 유의한 연관성이 나타났다(GMS vs. NET 진단, p = 1 × 10⁻⁶; NET 진단 vs. 조직 대사형, p = 1 × 10⁻⁶; GMS vs. 조직 대사형, p = 4.7 × 10⁻⁵). 특히 GMS6, NET 양성군, 조직 대사형 A 사이, 그리고 NET 음성군과 조직 대사형 A 사이에서 뚜렷한 연결 흐름이 관찰되었다(Fig. 4).
Fig. 4 Integrated analysis of gastric microbiota signatures and tissue metabotypes. Alluvial diagram summarizing the relative frequency relation ships among gastric microbiota signature, NET diagnosis, and tissue metabotypes. Grey, dark grey and black lines correspond to the control, NET-negative, and NET-positive groups, respectively. GMS, gastric microbiota signatures; NET, neuroendocrine tumor; NET−, NET-negative group; NET+, NET-positive group
Discussion
이 연구에서는 자가면역성 위염(AIG) 환자에서 위 신경내분비종양(NET)이 발생한 경우, 위 점막 관련 미생물군집(microbiota) 프로파일의 변화를 관찰하였다. 이는 지금까지 탐구되지 않았던 관점에서 AIG 병태생리에 대한 이해를 확장시켜 준다. 미생물 다양성 지표 중 α-다양성 지표인 비모수적 Shannon index와 Inverse Simpson index는 AIG 환자의 위 점막 관련 미생물군집에서 유의하게 감소하였다. 이러한 결과는 정상 위의 미생물군집이 AIG 환자에 비해 Pielou’s evenness, 종 풍부도(species richness), Simpson index가 유의하게 높았음을 보고한 이전 연구 결과와 일치한다[10]. 이러한 감소는 AIG 환자에서 미생물 다양성이 낮음을 의미하며, 이는 위장관 종양을 포함한 질환 상태와 낮은 미생물 다양성을 연관지은 기존 연구들과도 일치한다[24–26]. 또한 NET 양성군에서 변동성이 낮고 더 압축된 분포를 보였다는 점은 보다 균일한 미생물 조성이 존재함을 시사하며, 이는 NET 형성에 기여할 수 있다. Unweighted 및 weighted UniFrac distance를 활용한 β-다양성 분석에서도 AIG 및 NET 상태가 뚜렷하게 구별되는 미생물 조성과 연관되어 있음이 확인되었다.
세균 군집의 히트맵에서는 NET 양성군에서 Proteobacteria와 Fusobacteriota가 증가된 특징적인 미생물 프로파일이 확인되었다. Proteobacteria는 사람에게 다양한 질병을 일으키는 병원성 균주를 포함하는 그람음성 세균군이다[27]. 이전 연구에서는 Haemophilus parainfluenzae가 크론병[28] 및 비소세포폐암[29]과 연관되어 있음이 보고되었다. Fusobacteriota는 혐기성 그람음성 세균으로 구강과 위장관 미생물군집의 중요한 구성 요소이다. Fusobacterium periodonticum과 Fusobacterium nucleatum은 염증을 촉진하고 병원성을 유발하는 것으로 알려져 있다. Fusobacterium periodonticum은 식도암[30] 및 구강암[31]과 연관이 있으며, Fusobacterium nucleatum은 궤양성 대장염[32], 대장암 진행[33,34], 구강암[35]과 관련이 있다. 반대로, NET 양성군에서는 Firmicutes가 감소하였다. Firmicutes는 인체 건강 유지에 중요한 유익한 종을 다수 포함하는 그람양성 세균군이다. Streptococcus salivarius는 항염증 효과가 보고되었으며[36], 이 균주가 생산하는 salivaricins는 구강 병원균의 성장을 억제한다[37]. 또한 Veillonella atypica는 생쥐에서 러닝머신 운동 시간을 늘리고 염증성 사이토카인을 감소시키는 것으로 보고되었으며[38], 인간에서도 운동 능력을 유지하는 프로바이오틱스로 관찰되었다[39].
이러한 위 점막 관련 미생물군집의 변화는 미생물 불균형(dysbiosis)이 AIG 환자에서 위 NET 형성에 기여할 수 있음을 시사한다. 본 연구에서 고가스트린혈증과 ECL 세포 과형성은 NET 양성군에서 더 흔히 관찰되었으나 통계적으로 유의하지는 않았다. 그러나 이 요인들이 특정 세균 집단의 비율 변화에 잠재적으로 영향을 미쳤을 가능성이 있다.
AIG와 연관된 위 NET은 대개 위저선(fundic gland) 영역, 특히 위체부와 위저부에서 발생하며[40], 이는 AIG에서 관찰되는 위 점막 위축 부위와 일치한다. 본 연구에서도 NET 병변의 91.7%가 위체부 또는 위저부에 위치하였다. 점막 생검의 조직병리학적 평가 결과, 위체부 대만(greater curvature)의 장상피화생 정도는 NET 양성군에서 NET 음성군보다 낮았다. NET 환자의 사례 수가 제한적이기는 하지만, 이는 AIG와 관련된 NET이 장상피화생이 완전히 확립된 말기 단계 이전, 위염의 진행 단계에서부터 발생할 수 있음을 시사한다. NET의 기원으로 여겨지는 위 내분비 세포 미세군집(micronests)은 점막 내 선관 밖에서 증식하여 군집 구조를 형성하는 내분비 세포 집단이다. 따라서 위 NET은 장상피화생의 정도와는 독립적으로 발생할 수 있다.
미생물군 분석 결과 외에도, 대사체 분석에서는 대사체 피크 측정치의 유의한 변화가 확인되었다. AIG 환자에서는 포도당 대사가 해당과정(glycolysis)에서 다른 경로로 전환되었다. 이러한 전환과 TCA 회로 활성 감소는 에너지 생성 감소로 이어졌다. 그러나 다른 대사 경로가 이를 보상할 수 있으며, 이는 대사 재프로그래밍(metabolic reprogramming)을 시사한다. 이러한 변화는 미토콘드리아 기능 장애, 염증 환경, 위 점막 회복 증가, 후성유전학적 조절 이상 등에 의해 영향을 받을 가능성이 있다.
종합하면, 미생물군 분석에서는 NET 음성군과 NET 양성군 간 유의한 차이가 관찰된 반면, 대사체 분석에서는 대조군과 AIG 환자 간 뚜렷한 차이가 확인되었다. GMS와 조직 대사형의 통합 분석을 통해 생성된 올루비얼 다이어그램에서 특정 조직 대사형과 AIG 간 강한 연관성이 관찰되었으며, 특정 GMS와 NET 양성군 간 강한 연관성은 특정 GMS를 보유한 AIG 환자가 NET 발생 위험이 높을 수 있음을 시사한다. 이는 AIG 환자에서 숙주 조직 유래 대사체 변화가 위 점막 관련 미생물군집의 변화보다 먼저 발생하여, NET 발생에 관여하는 특정 미생물이 증식할 수 있는 미세환경을 조성할 가능성을 제시한다.
본 연구에는 몇 가지 한계가 있다. 첫째, AIG 및 연관된 NET은 일본에서 비교적 드물기 때문에 표본 수가 적었다. 이러한 결과를 검증하기 위해서는 대규모 다기관 연구가 필요하다. 둘째, 16S rRNA 시퀀싱 기법은 본질적으로 기능 및 경로 분석에 한계가 있으며, 세균 생체량이 상대적으로 적고, 대사체가 세균 유래가 아닌 숙주 유래라는 점은 숙주 조직 대사체 분석과 통합할 때 미생물군집 데이터의 해석을 더욱 어렵게 한다. 따라서 미생물군집, 숙주 유래 대사체, NET 간의 상호작용에 대한 인과적 기전을 규명하고, 잠재적인 임상적 적용 가능성을 탐색하기 위한 추가 연구가 필요하다.
결론적으로, 본 연구는 AIG 환자에서 발생한 위 NET과 관련하여 위 점막 미생물군집 프로파일이 뚜렷하게 변화했음을 보여준다. 미생물군 분석은 뚜렷한 미생물 불균형을 확인하였으며, 이는 NET 형성에 기여할 수 있다. 대사체 분석에서는 해당과정의 전환, TCA 회로 활성 감소, 대사 재프로그래밍이 확인되었다. 미생물군과 대사체의 통합 분석은 AIG 환자에서 숙주 대사의 변화가 점막 미생물 불균형에 선행하며, NET 형성을 촉진하는 미세환경을 조성할 수 있음을 시사한다.
<Abstract>
Background: Autoimmune gastritis (AIG) is a chronic atrophic gastritis that affects the gastric corpus, leading to achlorhydria, hypergastrinemia, and a precursor of neuroendocrine tumors (NETs). This study aimed to elucidate the underlying mechanisms of gastric NET formation in AIG by analyzing gastric mucosa-associated microbiota and host tissue-derived metabolite profiles.
Methods: A total of 19 patients diagnosed with AIG and 12 controls uninfected with Helicobacter pylori underwent gastric mucosal biopsies for microbiome analysis using next-generation sequencing with primers targeting the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, and metabolome analysis using capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry.
Results: Microbiome analysis revealed significantly reduced α-diversity indices in patients with AIG when compared with the control group. β-Diversity analysis showed distinct microbial compositions among the control, NET-negative, and NET-positive groups. The NET-positive group exhibited a significantly higher abundance of Proteobacteria and Fusobacteriota, particularly Haemophilus parainfluenzae, Fusobacterium periodonticum, and Fusobacterium nucleatum, whereas Firmicutes, including Streptococcus salivarius and Veillonella atypica, were significantly decreased compared with the NET-negative group. Metabolome analysis revealed a shift away from glycolysis and tricarboxylic acid cycle activity toward alternative metabolic pathways in patients with AIG. Integrated analysis of gastric microbiota signatures (GMS) and tissue metabotypes demonstrated significant associations among GMS, tissue metabotypes, and NET diagnosis.
Conclusions: These findings highlight marked shifts in gastric mucosa-associated microbiota profiles in patients with AIG who developed gastric NETs. Tissue-specific metabolic alterations may precede mucosal dysbiosis in patients with AIG and promote the development of a microenvironment implicated in NET formation.
Keywords: Autoimmune gastritis; Dysbiosis; Gastric microbiota; Metabolomics; Neuroendocrine tumors.
배경
자가면역성 위염(AIG)은 위체부를 침범하는 만성 위축성 위염으로, 무산증(achlorhydria)과 고가스트린혈증(hypergastrinemia)을 유발하며 신경내분비종양(NETs)의 전구 병변으로 알려져 있다. 본 연구는 AIG 환자에서 위 점막 연관 미생물총(microbiota)과 숙주 조직 유래 대사체 프로파일을 분석하여 위 NET 발생의 기전을 규명하는 것을 목표로 하였다.
방법
AIG로 진단된 환자 19명과 헬리코박터 파일로리(H. pylori)에 감염되지 않은 대조군 12명을 대상으로 위 점막 생검을 시행하였다. 미생물군 분석은 16S rRNA 유전자의 V3–V4 영역을 표적하는 프라이머를 이용한 차세대염기서열분석(next-generation sequencing)으로 수행되었으며, 대사체 분석은 모세관 전기영동 비행시간 질량분석(capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry)을 통해 수행되었다.
결과
미생물군 분석에서 AIG 환자는 대조군에 비해 유의하게 감소된 α-다양성 지수를 보였다. β-다양성 분석에서는 대조군, NET 음성군, NET 양성군 간에 뚜렷이 구분되는 미생물 조성이 나타났다. NET 양성군에서는 Proteobacteria와 Fusobacteriota가 유의하게 증가하였으며, 특히 Haemophilus parainfluenzae, Fusobacterium periodonticum, Fusobacterium nucleatum이 두드러졌다. 반면, NET 음성군에 비해 Streptococcus salivarius와 Veillonella atypica를 포함한 Firmicutes는 유의하게 감소하였다. 대사체 분석에서는 AIG 환자에서 해당과정(glycolysis) 및 TCA 회로(tricarboxylic acid cycle) 활성이 감소하고 대체 대사 경로로 전환되는 양상이 관찰되었다. 위 미생물 시그니처(GMS)와 조직 대사체 유형을 통합 분석한 결과, GMS, 조직 대사체, NET 진단 간에 유의한 연관성이 확인되었다.
결론
이번 연구는 AIG 환자에서 위 NET이 발생한 경우 위 점막 연관 미생물총 프로파일에 뚜렷한 변화를 보임을 보여주었다. 또한, 조직 특이적 대사 변화가 점막의 이생균총(dysbiosis)에 선행하여 NET 발생과 관련된 미세환경 조성에 기여할 수 있음을 시사한다.