Belloni L, Cingolani S, Mancabelli L, Stendardo G, Fabretti F, Vavallo M, Pivetta G, Dilaghi E, Esposito G, Annibale B, Ventura M, Milani C, Lahner E.
Microorganisms. 2026 Mar 31;14(4):789.
* 알파다양성: 미생물 무리 자체의 다양성 (얼마나 많은 수의 미생물이 있는지 (richness, abundance)와 얼마나 고르게 분포되어 있는지 (evenness))
* 베타다양성: 미생물 무리 구성이 대조군의 미생물 무리 구성과 어떻게 다른가에 대한 내용 (상대적인 값)
1. Introduction
자가면역성 위염(autoimmune gastritis, AIG)은 진행된 단계에서 위의 산분비샘 점막(oxyntic mucosa)의 위축을 특징으로 하는 만성 면역매개 질환이다. 면역계는 자가반응성 T세포를 통해 위의 산분비샘 점막을 손상시키며, 그 결과 철분과 비타민 B12 흡수에 필수적인 염산(hydrochloric acid)의 분비가 감소하게 된다 [1]. 또한 위산 장벽(gastric acid barrier)의 유지 기능 역시 저하된다 [2,3]. AIG는 전암성 상태(preneoplastic condition)로 간주되며, 향후 위 제1형 신경내분비종양(gastric type I neuroendocrine tumors, gt1NET) 및 위암으로 진행할 가능성이 있다 [4–7].
구강 및 위 미생물군(oral and gastric microbiomes)은 서로 구별되지만 상호 연결된 두 개의 미생물 환경으로, 모두 숙주의 국소적 및 전신적 건강에 영향을 미친다 [8,9]. 구강 세균은 침(saliva)과 함께 위장관으로 이동(translocation)하여 위장관 미생물 환경에 영향을 미치고, 위장관 항상성(homeostasis)에 변화를 일으킬 수 있으며, 염증 및 발암과도 연관될 수 있다 [10]. 구강은 인체 내 주요 세균 저장소 중 하나로, 사람의 구강 환경에 특화되어 적응한 다양한 미생물 군집(consortium of microorganisms)이 존재한다 [11]. 구강 미생물군은 치아 및 치주 질환(dental and periodontal diseases)에 관여하는 것으로 알려져 있다 [12,13]. 또한 최근에는 구강 미생물군과 위장관 질환, 특히 위장관 암 사이의 잠재적 연관성이 제기되고 있다 [14–18]. 더불어 구강질환 또는 치주질환과 위암 간의 연관성도 보고된 바 있다 [19–22].
한편, 위 미생물군(gastric microbiome) 역시 위암을 포함한 다양한 위 질환의 병태생리에 중요한 인자로 부각되고 있다 [8,13,23–25]. 정상 생리 상태에서는 강한 산성의 위내 환경(highly acidic intragastric environment) 때문에 일반 세균이 위 점막에 정착(colonization)하기 어렵다 [2,3]. 역사적으로도 위는 무균 상태(sterile)로 여겨졌으나, 이후 위 점막에서 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori, H. pylori)가 분리되면서 이러한 개념이 바뀌게 되었다 [8,23].
반면, AIG에서는 위내 미세환경(intragastric microenvironment)에 현저한 변화가 발생한다. 즉, 염산 분비 감소와 위 pH 상승이 나타나며, 이는 삼켜진 구강 세균이나 위내 세균의 과증식을 촉진한다. 이러한 변화는 위내 세균 불균형(gastric dysbiosis)을 유발할 수 있으며, 이는 숙주의 염증 반응에 영향을 미치고 위 질환의 발생 과정에 중요한 역할을 할 가능성이 있다. 위내 세균 불균형은 위염이 장상피화생(intestinal metaplasia) 및 위암으로 진행되는 과정에도 관여할 수 있다 [24,26–28].
현재까지의 지식으로는 AIG 환자에서 구강 및 위 미생물군 구성을 동시에 조사한 연구는 부족한 상태이다. 따라서 본 연구의 목적은 AIG 환자(증례군, cases)와 AIG가 없는 환자(대조군, controls)에서 구강 및 위 미생물군의 구성(composition)을 분석하고, 이들 사이의 잠재적인 차이점과 유사점을 평가하는 데 있다.
2. Materials and Methods
2.1. Study Design and Population
본 환자-대조군 연구(case–control study)에서는, 빈혈 또는 소화불량(dyspepsia)으로 인한 AIG의 임상적 의심이 있거나, 이미 진단된 AIG의 내시경 추적 관찰(endoscopic surveillance)을 위해 학술병원(academic hospital)의 전용 소화기내시경 세션에서 위내시경(gastroscopy)이 예정된 연속 환자(consecutive subjects)를 모집하였다(2023년 2월–4월). 각 대상자로부터 위내시경 시행 전 타액 샘플(saliva samples, n = 40)을 수집하였고, 위내시경 중에는 미생물군 분석(microbiota analyses)을 위한 조직 생검(biopsies, n = 40)과 updated Sydney system에 따른 위염의 조직병리학적 평가(histopathological assessment)를 위한 검체를 채취하였다 [29].
포함 기준(inclusion criteria)은 다음과 같았다: 18세 초과, 빈혈 또는 원인 미확인 소화불량(uninvestigated dyspepsia)으로 인해 AIG가 임상적으로 의심되는 경우, 혹은 이미 진단된 AIG 환자에서 내시경 추적 관찰이 필요한 경우였다.
제외 기준(exclusion criteria)은 다음과 같았다: 18세 미만, 불완전한 위내시경(incomplete gastroscopy), 연구 등록 2개월 이내의 급성 위장염(gastroenteritis) 또는 대장염(colitis), 연구 등록 1개월 이내의 proton pump inhibitor, 항생제(antibiotics), 프로바이오틱스(probiotics), 또는 항암화학요법(chemotherapy) 사용, 그리고 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 양성이었다.
각 환자는 임상 설문지(clinical questionnaire)를 작성하였으며, 여기에는 인구학적 정보(demographics), 성별(gender), 국적(nationality), 거주 지역(region of residence), 교육 수준(education level), 고용 상태(employment status), 생활습관 항목(lifestyle items; 흡연, 음주, 신체활동, 식이), 체질량지수(body mass index), 위암 가족력(family history for gastric cancer), 동반질환(comorbidities), 위내시경 시행 사유(reason for gastroscopy), 복용 약물(drugs), 그리고 구강 위생과 관련된 항목들이 포함되었다. 구체적으로는 껌이나 사탕 사용(use of chewing gums or candies), 하루 칫솔질 횟수(daily tooth brushing), 구강세정제 사용(use of mouth-washing), 마지막 구강 위생 관리(last oral hygiene appointment), 마지막 치과 검진(last dental check-up), 가철성 또는 고정성 의치(removable or fixed dentures), 치과 또는 치주 질환의 병력(history of dental or periodontal diseases) 등이 조사되었다.
연구에 등록된 모든 환자는 서면 동의(informed consent)를 제공하였으며, 본 연구는 지역 윤리위원회(local ethical committee)의 승인을 받았다(7295/2022).
2.2. Saliva Sample Collection
포함된 모든 대상자는 예정된 위내시경 전날 전화 연락을 받았으며, 타액 샘플(saliva sample) 채취 방법에 대한 안내를 받았다. 환자들은 채취 당일 아침에 칫솔질을 하거나, 구강세정제(mouthwash)를 사용하거나, 껌 및 사탕(chewing gum/candies)을 섭취하지 않도록 지시받았다. 또한 샘플 채취 당일에는 흡연도 금지되었다.
참가자들은 물로 입안을 헹군 뒤 30분을 기다린 후, DNA-Shield(Zymo Research, Irvine, CA, USA)가 포함된 멸균 튜브(sterile tube)에 타액 샘플을 제공하였다. DNA-Shield는 핵산(nucleic acids)을 안정화시키고 상온에서 미생물의 완전성(microbial integrity)을 보존하는 역할을 한다. 그러나 샘플은 이후 즉시 −20℃에서 냉동 보관되었다.
2.3. Gastric Biopsies
위내시경(gastroscopy) 시행 중, 위 체부 점막(corpus mucosa)에서 채취한 생검 조직 중 첫 번째 검체(one corpus mucosa biopsy, the first one taken)는 미생물군 분석(microbiome analysis)을 위해 멸균 겸자(sterile forceps)를 사용하여 별도로 확보하였다. 해당 조직은 즉시 DNA-Shield가 담긴 Eppendorf 튜브에 넣어졌으며, 곧바로 −20℃에서 보관되었다.
추가적으로 updated Sydney system에 따라 총 5개의 위 생검 조직(gastric biopsies)을 채취하였다. 구체적으로는 전정부(antrum)에서 2개, 위각부(angularis incisura)에서 1개, 체부-기저부(corpus-fundus)에서 2개를 채취하였으며 [30], 이들 검체는 위염의 조직병리학적 평가(histopathological assessment of gastritis)를 위해 제출되었다.
2.4. Histopathological Assessment of Gastritis
위 생검 조직(gastric biopsy samples)은 hematoxylin and eosin(H&E) 염색을 시행한 후, 위 병리(gastric pathology)에 높은 전문성을 가진 병리의사(pathologist)에 의해 평가되었다. 각 검체는 updated Sydney system에 따라 염증(inflammation), 위축(atrophy), 장상피화생(intestinal metaplasia), 그리고 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 감염 여부를 평가하였다 [29].
AIG 진단은 체부선 위축(corpus glandular atrophy), 산분비샘(oxyntic gland) 소실, ECL 세포 과형성(ECL cell hyperplasia), 그리고 가성유문선화생(pseudopyloric metaplasia) 및/또는 장상피화생이 존재하면서, 전정부 점막(antral mucosa)은 보존(spared)된 경우를 기준으로 하였다. 또한 모든 환자에서 항벽세포 자가항체(anti-parietal cell autoantibodies)가 양성이었다 [1,30].
대조군(controls)은 AIG가 없는 대상자로 정의하였으며, 조직학적으로 정상 위 점막(histologically normal gastric mucosa)을 보이거나, 또는 체부의 산분비샘 점막(corpus oxyntic mucosa)은 정상인 상태에서 전정부에 국한된(antral-restricted), 비위축성(non-atrophic), 비활동성(non-active), H. pylori 음성 위염을 가진 경우를 포함하였다.
2.5. DNA Extraction and Sequencing
각 검체(타액 샘플 및 위 생검 조직)는 제조사의 지침(Qiagen, Hilden, Germany)에 따라 QIAmp DNA minikit를 이용하여 DNA 추출을 시행하였다. 추출된 DNA는 Illumina Nextera XT DNA Library Preparation Kit를 사용하여 준비하였으며, Illumina NexteraXT 프로토콜을 따랐다. 구체적으로 DNA 샘플은 효소적 절편화(enzymatic fragmentation), 바코딩(barcoding), 그리고 자기 비드(magnetic beads)를 이용한 정제 과정을 거쳤다.
이후 샘플은 형광 기반의 Qubit 정량 시스템(fluorometric Qubit quantification system; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)을 이용해 정량하였고, 이어서 2200 Tape Station Instrument(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)에 적재하여 4 nM으로 정규화(normalization)하였다. 이후 Illumina MiSeq sequencer와 MiSeq Reagent Kit v3(Illumina Inc., San Diego, CA, USA)를 이용하여 paired-end sequencing을 수행하였다.
생성된 fastq 파일은 METAnnotatorX2 software(version 1.0)를 이용하여 저품질(low-quality) read와 인간(Homo sapiens) 유래 read를 제거하는 필터링 과정을 거쳤으며, 이는 매뉴얼에 보고된 표준 필터링 조건을 따랐다(DOI:10.1128/mSystems.00583-21). 이후 National Center for Biotechnology Information(NCBI)에서 확보한 genome 데이터베이스를 수동으로 선별(manually curated) 및 전처리(pre-processed)한 데이터베이스를 이용하여, 100,000개의 read에 대한 분류학적 분석(taxonomic classification)을 MegaBLAST(PMID: 26250111)로 수행하였다. 전체 분석 과정은 METAnnotatorX2 매뉴얼을 기반으로 하였다 [31,32].
2.6. Statistical Analysis
기술통계(descriptive statistics)는 전체 대상자 수에 대한 빈도와 비율[number (%)] 또는 평균 ± 표준편차(mean ± SD), 혹은 중앙값(범위)[median (range)]로 표현하였다.
알파 다양성(alpha-diversity)은 Shannon–Wiener diversity index를 이용하여 계산하였으며, 이는 상대적 풍부도(relative abundance, evenness)를 고려하여 균종의 풍부성(taxa richness)에 대한 정보를 제공한다.
타액 샘플과 생검 조직 샘플을 각각 분리하여 분석하였으며, Bray–Curtis 비유사성 행렬(Bray–Curtis dissimilarity matrix)을 기반으로 베타 다양성(beta-diversity) 분석을 수행하였다. 결과는 principal coordinates analysis(PCoA)를 이용한 3차원 그래프로 시각화하였으며, 증례군(cases)과 대조군(controls)을 서로 다른 색상으로 표시하였다.
또한 증례군과 대조군 간 세균 종(bacterial species)의 유의한 상관관계를 평가하기 위해 Spearman 상관분석(Spearman correlation analysis)을 시행하였고, 다중 비교 보정을 위해 FDR Benjamini–Hochberg correction을 적용하였다. 마지막으로, 개별 대상자 간 sharing analysis를 수행하여 구강과 위 사이에서 세균 종의 이동 또는 전이(passage/transition)가 존재할 가능성을 평가하였으며, 샘플은 증례군과 대조군으로 구분하여 분석하였다.
독립표본 t검정(independent t-test)은 1000회 bootstrap을 적용하여 SPSS(version 2.0, IBM, www.ibm.com/software/it/analytics/spss; access 15 March 2026)를 사용해 수행하였다. 상관분석(correlation analyses)은 RStudio(RStudio Team, version 2.0; RStudio: Integrated Development for R. RStudio, PBC, Boston, MA, USA; www.rstudio.com)에서 “Hmisc” 및 “corrplot” 패키지를 사용하여 시행하였으며, Pearson 상관행렬(Pearson correlation matrices)을 생성하였다.
사후 검정력 분석(post hoc power analyses)은 alpha-diversity와 세균 풍부도(bacterial abundance)에 대해 유의수준(alpha-level) 0.05에서 수행하였으며, MedCalc® Software Ltd.(Ostend, Belgium, version 22.009)를 사용하였다.
3. Results
포함된 총 40명의 대상자 중, 20명은 조직학적으로 AIG로 진단되어 증례군(cases)으로 분류되었고, 나머지 20명은 정상 위 점막(normal gastric mucosa, n = 18)을 보이거나, 또는 체부 산분비샘 점막(corpus oxyntic mucosa)은 정상인 상태에서 전정부에 국한된(antral-restricted), 비위축성(non-atrophic), 비활동성(non-active), H. pylori 음성 위염(n = 2)을 보여 대조군(controls)으로 분류되었다.
증례군과 대조군의 중앙 연령(median age)은 각각 69세와 58세였으며, 여성 비율은 각각 75%와 45%였다(p > 0.05). 또한 국적(nationality), 거주 지역(region of residence), 교육 수준(education level), 고용 상태(employment status), 생활습관(lifestyle), 그리고 구강 위생 관련 항목(oral hygiene items) 역시 두 군 간 차이가 없었다(Table 1).
AIG 증례군 중에서는 체부 위축(corpus atrophy)이 중증(severe)인 경우가 55%, 중등도(moderate)가 35%, 경도(mild)가 10%였다. 장상피화생(intestinal metaplasia)은 85%에서 관찰되었다. 위 체부의 위축 및 장상피화생의 평균 ± 표준편차(mean ± SD) 중증도 점수(severity score)는 각각 2.4 ± 0.8 및 1.2 ± 0.7이었다. 반면 만성 염증세포 침윤(chronic inflammatory infiltrate)과 활동성 염증세포 침윤(active inflammatory infiltrate)의 중증도 점수는 각각 1.6 ± 0.7 및 0.1 ± 0.3이었다.
Supplementary Table S1에는 증례군과 대조군에서 위 체부 및 전정부 점막의 조직병리학적 변화(histopathological changes)에 대한 상세 평균 중증도 점수가 제시되어 있다.
3.1.Alpha- and Beta-Diversity
알파 다양성(alpha-diversity)은 개별 샘플 내 다양성(diversity within single samples)을 나타내는 기술적 지표로, 필터링 후 분류된 read를 대상으로 Shannon–Wiener index를 이용하여 분석하였다. 이 지표는 종(species) 분포의 풍부도(abundance, evenness)와 균등성(equity)을 함께 고려한다.
필터링 후 분류된 read 수로 표현한 세균 풍부도(bacterial abundance)는, AIG 증례군에서 타액 샘플이 위 생검 조직보다 유의하게 높았다(중앙값, IQR: 27,492 [12,842–39,663] vs. 159 [95–442], p < 0.0001; 평균 ± SD: 27,167 ± 15,472 vs. 325.4 ± 305.3, p < 0.0001). 또한 AIG가 없는 대조군에서도 동일한 경향을 보였다(중앙값, IQR: 25,648 [12,252–42,751] vs. 113 [52–173], p < 0.0001; 평균 ± SD: 30,974 ± 22,654 vs. 160.1 ± 149.7, p < 0.0001).
두 신체 부위(body compartments)에서 증례군과 대조군을 비교한 결과, 위 생검 조직에서의 세균 풍부도는 증례군이 대조군보다 거의 2배 높았으나 통계적 유의성에는 도달하지 못하였다(mean ± SD: 325.4 ± 305.3 vs. 160.1 ± 149.7, p = 0.06, post hoc power = 0.47). 반면, 타액 샘플에서는 증례군과 대조군 간 세균 풍부도 차이가 없었다(mean ± SD: 27,167 ± 15,472 vs. 30,974 ± 22,654, p = 0.54, post hoc power = 0.09) (Supplementary Figure S1).
Figure S1: Comparison of classified reads (bacterial abundance) after % and n° filtering of gastric biopsy (p = 0.06) and saliva (p = 0.54) samples between cases and controls; CA = cases: n = 20 patients with autoimmune atrophic gastritis; CO = n = 20 controls without autoimmune atrophic gastritis.
상대적 풍부도(relative abundance, evenness)를 고려한 균종 풍부성(taxa richness)을 평가하기 위해 Shannon–Wiener diversity index를 계산하였으며, 결과는 Figure 1에 도식화하였다.
Figure 1. Biodiversity and relative abundance (evenness) as calculated by the Shannon–Wiener index in saliva samples (left graph) and gastric biopsies (right graph) of 20 cases (CA) with autoimmune gastritis and 20 controls (CO) without autoimmune gastritis.
위 생검 조직(gastric biopsy samples)에서는 AIG 증례군이 대조군보다 Shannon–Wiener diversity index가 낮았다(2.55 vs. 2.61, p = 0.0014). 이는 증례군에서 생물다양성(biodiversity)과 상대적 풍부도(evenness)가 감소하였음을 의미하며, 세균 불균형(dysbiosis)을 시사한다.
반대로 타액 샘플에서는 AIG 증례군이 대조군보다 Shannon–Wiener diversity index가 더 높았다(2.83 vs. 2.73, p = 0.0000). 이는 증례군에서 생물다양성과 상대적 풍부도가 대조군보다 더 높음을 의미한다.
베타 다양성(beta-diversity)은 두 생태계(ecosystems) 또는 샘플 군(sample groups) 사이의 차이 또는 거리(difference or distance)를 나타내는 지표로, AIG 증례군과 대조군의 타액 및 위 생검 조직 샘플에 대해 Bray–Curtis 비유사성 행렬(Bray–Curtis dissimilarity matrix)을 이용하여 계산하였다. 결과는 3차원 principal coordinates analysis(PCoA)로 시각화하였다.
Figure 2에서 보이는 바와 같이, AIG 증례군과 대조군 간 베타 다양성은 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 이는 타액 샘플(p = 0.591, post hoc power = 0.08)과 위 생검 조직(p = 0.676, post hoc power = 0.06) 모두에서 동일하였다.
즉, 주로 세균의 존재 빈도와 풍부도(abundance)를 기반으로 하는 Bray–Curtis 비유사성 분석에서는, 본 연구 집단에서 증례군과 대조군 간 유의한 차이가 확인되지 않았다.
Figure 2. Beta-diversity analysis (based on Bray–Curtis dissimilarity matrix) of saliva (upper graph) and gastric biopsy (lower graph) of 20 cases with autoimmune gastritis (CA) and 20 controls without (CO) and represented by PCoA (principal coordinates analysis) in 3D. Cases are depicted in red and controls in blue. Beta-diversity between CA and CO was not statistically different, neither in saliva samples (p = 0.591) nor in gastric biopsies (p = 0.676), indicating that Bray–Curtis dissimilarity, mainly based on occurrence data (abundance), did not show significant differences between cases and controls in this specific study population.
3.2.Taxonomy
전체 연구 대상군에서, 유병률(prevalence) 2.5% 이상인 세균 분류군(bacterial taxa)의 총 개수는 타액 샘플에서 위 생검 조직보다 거의 4배 많았다. 즉, 타액 샘플에서는 498종, 위 생검 조직에서는 128종이 확인되었으며, 비율은 3.9:1이었다.
전체 증례군 및 대조군의 타액 샘플에서 17개의 세균 분류군이 100%의 유병률로 확인되었다. 여기에는 Streptococcus oralis, Streptococcus mitis, Streptococcus salivarius, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus infantis, Streptococcus australis 및 Streptococcus unknown species, Rothia mucilaginosa, Rothia dentocariosa 및 Rothia unknown species, Prevotella jejuni 및 Prevotella unknown species, Actinomyces unknown species, Haemophilus parainfluenzae, Veillonella unknown species, Granulicatella unknown species 및 Granulicatella adiacens 등이 포함되었다.
또한 12개의 다른 세균 분류군이 97.5%의 높은 유병률을 보였는데, 여기에는 Prevotella histicola, Prevotella melaninogenica, Prevotella nigrescens, Prevotella intermedia, Prevotella denticola, Streptococcus pseudopneumoniae, Gemella sanguinis, Haemophilus unknown species, Lancefieldella unknown species, Veillonella atypica/rogosae, Veillonella dispar, Veillonella parvula 등이 포함되었다.
위(stomach)에서 가장 흔하게 발견된 상위 5개 세균 분류군은 Cutibacterium acnes(57.5%), Streptococcus salivarius(45%), Streptococcus unknown species(45%), Streptococcus mitis(40%), 그리고 Prevotella unknown species(42.5%)였다. 한편 Actinomyces unknown species, Prevotella melaninogenica, Cutibacterium unknown species의 유병률은 각각 37.5%, 37.5%, 35%로 상대적으로 낮았다.
이후 세균 종 수준(taxonomy level of bacterial species)에서의 차이를 평가하기 위해 Spearman 상관분석(Spearman correlation analysis)을 이용한 변수 간 상관분석(correlation analysis)을 시행하였다.
Table 2에서 나타난 바와 같이, 타액 샘플에서는 AIG 증례군과 Gemella sanguinis 및 Gemella unknown species, Chryseobacterium unknown species, Fusobacterium unknown species, Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium periodonticum, 그리고 Prevotella multisaccharivorax 사이에 유의한 양의 상관관계(significant positive association)가 관찰되었다.
반면 위 생검 조직에서는 AIG 증례군과 Streptococcus oralis, Gemella unknown species, Fusobacterium pseudoperiodonticum, Veillonella rogosae, 그리고 Gemella sanguinis 사이에 유의한 양의 상관관계가 확인되었다.
3.3.Sharing Analysis of Bacterial Taxa Between the ORAL and the Gastric Compartment
구강과 위 사이에서 세균 종(bacterial species)의 잠재적 연관성을 평가하기 위해, 샘플을 증례군(cases)과 대조군(controls)으로 구분한 후, 개별 대상자(single subjects)의 구강 및 위 구획(compartments) 사이에서 공유(shared)되는 세균 종에 대한 분석(sharing analysis)을 수행하였다.
Supplementary Figure S2에는 AIG 증례군과 대조군에서 타액과 위 생검 조직 사이에 공유된 세균 분류군(shared bacterial taxa)이 상세히 제시되어 있다.
Figure S2. Shared bacterial taxa between saliva and gastric biopsies in cases with autoimmune atrophic gastritis and in controls. CA, cases; CO, controls.
Table 3에서 보이는 바와 같이, AIG 증례군에서 가장 흔하게 공유된 세균 분류군은 Streptococcus oralis, Streptococcus mitis, 그리고 Prevotella histicola였다. 주목할 점은 Fusobacterium pseudoperiodonticum, Gemella sanguinis, Gemella unknown species, Veillonella rogosae의 네 가지 세균 분류군은 AIG 증례군에서만 구강과 위 사이에 공유되었고, 대조군에서는 관찰되지 않았다는 점이다. 이는 AIG에서의 비산성(non-acidic) 위내 환경(intragastric microenvironment)에 의해 이러한 세균의 생존 및 정착이 촉진되었을 가능성을 시사한다.
20명의 AIG 증례군 중, 7명(35%)에서는 구강과 위 사이에 공유된 세균이 전혀 없었다. 5명(25%)에서는 1개의 세균 분류군만 공유되었으며, 각각 4명(20%), 2명(10%), 2명(10%)에서는 2개, 3개, 4개의 세균 분류군이 공유되었다.
특히 Gemella sanguinis는 단독으로 공유된 경우는 없었으며, 항상 Streptococcus 또는 Prevotella와 같은 다른 세균 분류군과 함께 동반되어(shared in association) 나타났다(Table 4).
또한 구강과 위 사이의 세균 공유 여부에 따라 AIG 증례군 사이에서 임상적(clinical) 차이(연령, 성별, 임상 증상, 구강 위생)나 조직학적(histological) 차이(체부 위축의 중증도, 장상피화생)는 관찰되지 않았다.
4. Discussion
현재까지 알려진 바에 따르면, 본 연구는 AIG 환자에서 구강 및 위 미생물군의 구성을 동시에 평가한 최초의 연구이다. AIG는 위산 분비 저하와 저산증(hypochlorhydria)을 특징으로 하는 잘 알려진 질환이며, 본 연구에서는 이를 정상적인 위산 분비를 가진 대상자와 비교하였다.
정량적 관점에서 보면, 본 연구 결과는 필터링 후 분류된 read 수(classified reads after filtering)를 기준으로 할 때, AIG 환자와 대조군 모두에서 구강 미생물군(oral microbiota)이 위 미생물군(gastric microbiota)보다 훨씬 풍부하다는 것을 보여주었다(p < 0.0001). 또한 타액 샘플에서 확인된 전체 세균 분류군(bacterial taxa)의 수는 위 점막에서 확인된 수보다 약 4배 많았다(n = 498 vs. 128, ratio 3.9:1). 이는 첫째, 위는 구강보다 미생물 정착(colonization)이 적은 환경이라는 점, 둘째, 대부분 인간 DNA로 구성된 위 생검 조직에서는 세균 DNA의 추출 및 증폭이 기술적으로 더 어렵다는 점 때문으로 해석할 수 있다. 반면 타액은 액체-점성(liquid–viscous) 환경이므로 세균 DNA 추출이 상대적으로 용이하다.
또한 본 연구는 AIG 환자에서 대조군보다 Shannon–Wiener biodiversity index가 낮다는 점을 재확인하였다. 이는 AIG에서 생물다양성(biodiversity)과 상대적 풍부도(relative abundance, evenness)가 감소해 있음을 의미하며, 위내 세균 불균형(gastric dysbiosis)을 시사한다. 이러한 결과는 기존 보고들과도 일치한다 [26,28].
AIG에서 세균 다양성이 감소하는 이유는 만성 염증(chronic inflammation)과 비산성 위내 pH(non-acidic intragastric pH)로 특징지어지는 특수한 위내 환경 때문일 수 있다. 정상적으로 위산은 세균 제거(scavenging) 역할을 수행하지만, AIG에서는 이러한 기능이 저하되어 침과 함께 삼켜진 비정형 위내 세균(non-typical intragastric bacteria), 특히 구강 유래 미생물(oral microbiota-derived bacteria)의 과증식을 촉진할 가능성이 있다 [17,27,28,33–37]. 이 개념은 오래전부터 가설로 제시되어 왔지만, 실제 데이터로 입증되지는 못했다. 본 연구는 구강 및 위 미생물군을 동시에 평가함으로써 이러한 가설을 뒷받침하는 근거를 제공한다.
대조군과 비교했을 때, AIG 환자의 타액에서는 Gemella sanguinis, Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium periodonticum, Fusobacterium unknown species, 그리고 Prevotella multisaccharivorax가 유의하게 증가해 있었다. 반면 위 생검 조직에서는 Streptococcus oralis, Gemella sanguinis, Fusobacterium pseudoperiodonticum, Veillonella rogosae가 유의하게 풍부하였다.
실제로 AIG 환자에서 구강과 위 사이에 가장 흔하게 공유된 세균은 Streptococcus oralis, Streptococcus mitis, Prevotella histicola였으며, Fusobacterium pseudoperiodonticum, Gemella sanguinis 및 Gemella unknown species, Veillonella rogosae는 AIG 환자에서만 구강과 위 사이에 공유되었고 대조군에서는 관찰되지 않았다.
이 결과는 AIG에서 관찰되는 주요 세균들이 구강 기원(oral origin)임을 시사하는 첫 번째 근거라고 할 수 있다. 특히 AIG에서 가장 흔하게 공유된 균종이 Streptococci 및 Prevotellae였고, AIG에서만 구강과 위 사이에 공유된 세균들이 Fusobacterium pseudoperiodonticum, Gemella sanguinis, Veillonella rogosae와 같이 전형적인 구강 상재균(oral cavity colonizers)이었다는 점은 이를 더욱 뒷받침한다.
이러한 현상은 정상적인 위산 분비를 가진 대조군에서는 관찰되지 않았으며, 이는 AIG에서의 위산 분비 저하와 그에 따른 높은 위내 pH, 그리고 만성적으로 염증이 있는 위 점막 환경이 이러한 구강 세균들이 위에 존재할 수 있도록 하는 중요한 조건임을 강하게 시사한다.
특히 Fusobacterium pseudoperiodonticum은 최근 기술된 구강 혐기성 세균(oral anaerobe)으로, 사람의 혀 및 치은연하 치태(subgingival plaque)에서 처음 분리되었으며, 그 기원이 구강이라는 점을 뒷받침한다 [38]. 이 균은 다균종 생물막(multispecies biofilm) 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
한편 Fusobacterium nucleatum에 대한 최근 연구에서는 강산성 환경(pH 1.5)에 대한 높은 저항성이 보고되었는데, 이는 세포막 지질 조성, 특히 erucic acid의 존재와 관련된 것으로 알려져 있다 [39]. 그러나 현재까지 Fusobacterium pseudoperiodonticum에서 동일한 기전이 존재한다는 직접적인 증거는 없다.
Gemella sanguinis는 잘 알려진 핵심 구강 공생균(core oral commensal)이며, 최근 연구들에서도 주로 구강 미생물 환경에 적응된 균으로 확인되었다. 반면 위에서는 중증 위산 장벽 손상(severe impairment of gastric acid barrier)과 같은 병적 상태에서만 관찰된다 [40].
Veillonella rogosae는 구강-위 전이(oral–gastric translocation)를 가장 잘 설명할 수 있는 세균이다. 이 균은 치태(dental plaque)에서 흔히 분리되는 구강 세균이며, 초기 생물막 형성(early biofilm formation)에 관여한다 [41]. 또한 다른 세균이 생성한 lactate를 에너지원으로 사용하고 nitrate를 nitrite로 환원시키는 대사적 특성을 가지고 있어, 구강 세균 군집과 함께 이동할 가능성이 생물학적으로 타당하다.
반면 이러한 세균들에 대해 정상적인 산성 위 환경에서 생존하거나 위산에 저항하는 명확한 기전은 아직 직접적으로 입증되지 않았다. 또한 본 연구는 단면연구(cross-sectional study)이므로, 관찰된 공유 세균들이 실제 전이(translocation)를 의미하는지, 아니면 유사한 선택 압력(selective pressures)에 의해 독립적으로 정착한 것인지는 구분할 수 없다. 따라서 본 연구는 구강 세균과 위 미생물군 간의 연관성(association)은 보여주지만, 위 세균 불균형의 인과관계(causation)를 입증하는 것은 아니다.
AIG와 연관된 이러한 구강 세균들은 위암 및 위암 전구 병변(preneoplastic conditions)과의 관련성 측면에서도 흥미롭다. Pimentel-Nunes 등은 정상 점막, 진행성 위축성 위염 및 장상피화생, 초기 위암 환자의 위 생검 조직에서 full-length 16S rRNA sequencing을 시행한 결과, 모든 단계에서 세균 불균형(dysbiosis)을 관찰하였고, 특히 장상피화생 단계에서 더욱 뚜렷하였다 [42]. 이 연구에서는 Gemella와 Streptococcus가 정상군에서 장상피화생 및 위암으로 갈수록 점진적으로 증가하였다(Gemella: 1.48%→3.9%, p = 0.014; Streptococcus: 19.3%→33.7%, p = 0.04).
또한 Gemella는 위암 환자의 구강 면봉(oral swab) 샘플에서도 증가되어 있었다 [43]. Streptococcus 역시 위암 환자의 구강과 위, 그리고 위암 조직에서 증가되어 있었으며 [37,44], H. pylori 음성 위암 환자에서도 증가가 보고되었다 [45].
구강 세균의 일종인 Fusobacterium 역시 H. pylori 감염 여부와 무관하게 위암 및 그 전구 병변과 연관되어 있다고 알려져 있다 [25,33,46–48]. 구강 내 Fusobacterium은 위축성 위염 및 장상피화생 환자에서 정상 대조군보다 유의하게 증가해 있었으며, 이는 이들 환자에서의 구강 세균 불균형을 시사한다 [17,49]. Fusobacterium nucleatum은 위암 조직 [49,50] 및 위축성 위염 환자의 타액에서 정상인보다 증가되어 있었다 [51].
이러한 데이터와 본 연구 결과를 종합하면, AIG와 같은 저산성 전암성 상태(hypochlorhydric precancerous conditions)에서는 위 세균 불균형이 구강 유래 세균과 연관되어 있으며, 위산 분비 저하 상태에서는 구강 미생물군의 구성이 위 미생물군 구성에 영향을 미칠 수 있음을 강하게 시사한다. 이는 AIG 환자에서 구강 위생(oral hygiene), 치과 건강(dental health), 치주 건강(periodontal health)의 중요성에 대한 관심을 환기시킨다.
저자들은 본 연구의 몇 가지 제한점을 인지하고 있다. 첫째, 총 80개의 샘플(타액 40개, 생검 40개)을 분석하였지만, 특히 하위 분석(sub-analysis)을 수행하기에는 표본 수가 충분하지 않을 수 있으며, 이를 보완하기 위해 post hoc power analysis를 시행하였다.
둘째, 식이(diet)는 미생물군 연구에서 중요한 변수이지만, 본 연구에서는 특별한 식이 조절을 시행하지 않았다. 다만 대상자 중 특수 식이를 하는 경우는 없었고, 모두 항생제, pre-/probiotics, 위산분비억제제 사용을 중단한 상태였다.
셋째, AIG는 위암 위험이 증가된 질환이지만 [6,52], 연구 등록 기간 동안 새롭게 진단된 위암 환자가 없어, 위암을 동반한 AIG 환자에 대한 분석은 수행할 수 없었다.
넷째, 대조군 중 2명은 전정부 국한 비활동성 비위축성 H. pylori 음성 위염을 가지고 있었으나, 이들을 제외한 분석에서도 결과는 변하지 않았다.
다섯째, 본 연구의 단면연구 설계상 구강 세균 불균형이 위 세균 불균형보다 먼저 발생하는지, 혹은 그 반대인지를 판단할 수 없다. 이러한 방향성(directionality)을 규명하기 위해서는 종단연구(longitudinal studies) 또는 기전 연구(mechanistic experiments)가 필요하다.
본 연구의 강점 중 하나는 기존의 16S rRNA sequencing과 달리, 보다 광범위한 세균 및 분류학적 프로파일링(taxonomic profiling)이 가능한 비표적(un-targeted) microbiome sequencing 접근법을 사용하였다는 점이다.
16S rRNA 유전자는 계통발생학적 표지자(phylogenetic marker)로서 비용 효율적이고 효율적인 방법이지만, hypervariable region 선택이나 primer 의존적 PCR 증폭(primer-dependent PCR amplification)과 같은 편향(bias)의 영향을 받을 수 있으며, 이는 미생물 구성 평가(microbial composition assessment)의 변동성을 초래할 수 있다.
반면 shotgun metagenomics는 비용이 많이 들지만, 더 넓은 분류학적 해상도(taxonomic resolution)를 제공하며, 알려지지 않은 세균 종(species) 및 균주(strains)를 탐지할 가능성을 가진다. 다만 그 대가로 더 높은 수준의 생물정보학적 분석 부담(bioinformatic burden)이 요구된다 [53].
결론적으로, 본 연구는 AIG에서 위내 세균 불균형(gastric dysbiosis)의 존재를 재확인하였다. 또한 구강 유래 세균 분류군(oral taxa)이 AIG와 더 흔하게 연관되어 있었으며, 구강과 위 사이에서 공유되는 양상도 관찰되었다. 이러한 결과는 AIG에서 구강 미생물군(oral microbiota)이 위 세균 불균형과 연관되어 있음을 보여주며, 구강 정상 미생물 균형(oral eubiosis)의 중요성에 주목하게 한다.
<Abstract>
Autoimmune gastritis (AIG) in its advanced atrophic stage is characterized by reduced acid secretion, dysbiosis, and gastric cancer (GC) risk. Swallowed oral bacteria surviving in increased intragastric pH may play a carcinogenic role. Oral microbiota was linked to increased GC risk. In AIG, the concomitant assessment of oral and gastric microbiota has not yet been performed. This study aimed to investigate the oral and gastric microbiota in AIG patients to clarify the role of oral bacteria in gastric dysbiosis. A case-control study on n = 20 histologically diagnosed AIG patients and n = 20 controls without AIG is conducted. Saliva samples were obtained from subjects who were fasting and without toothbrushing. Within 1 h, gastroscopy with biopsies (for histopathology and DNA extraction) was performed. Saliva (n = 40) and biopsy (n = 40) samples were frozen at -20 °C. DNA was extracted and prepared; paired-end sequencing was performed (IlluminaMiSeq-sequencer, San Diego, CA, USA). Bacterial abundance in biopsies was higher in AIG than in controls (p = 0.06), but was not different in the saliva (p = 0.54) samples. In biopsies, AIG showed a lower Shannon-Index than controls (p = 0.001). In saliva studies, AIG showed a higher Shannon-Index than controls (p = 0.0). In biopsies, Streptococcus oralis, Fusobacterium pseudoperiodonticum, Veillonella rogosae, and Gemella sanguinis were more frequent in AIG (p < 0.03). The most abundantly shared taxa between saliva and biopsy were S. oralis and Prevotella histicola; Gemella sanguinis, Fusobacterium pseudoperidonticum, and Veillonella rogosae were shared in AIG patients only. This study confirmed gastric dysbiosis in AIG. Oral taxa were more commonly associated with AIG and shared between the mouth and the stomach. In AIG, the oral microbiota is associated with gastric dysbiosis, highlighting the importance of oral eubiosis in patients with impaired gastric acid secretion.
Keywords: autoimmune gastritis; gastric dysbiosis; hypochlorhydria; microbiota.
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* 알파다양성: 미생물 무리 자체의 다양성 (얼마나 많은 수의 미생물이 있는지 (richness, abundance)와 얼마나 고르게 분포되어 있는지 (evenness))
* 베타다양성: 미생물 무리 구성이 대조군의 미생물 무리 구성과 어떻게 다른가에 대한 내용 (상대적인 값)
1. Introduction
자가면역성 위염(autoimmune gastritis, AIG)은 진행된 단계에서 위의 산분비샘 점막(oxyntic mucosa)의 위축을 특징으로 하는 만성 면역매개 질환이다. 면역계는 자가반응성 T세포를 통해 위의 산분비샘 점막을 손상시키며, 그 결과 철분과 비타민 B12 흡수에 필수적인 염산(hydrochloric acid)의 분비가 감소하게 된다 [1]. 또한 위산 장벽(gastric acid barrier)의 유지 기능 역시 저하된다 [2,3]. AIG는 전암성 상태(preneoplastic condition)로 간주되며, 향후 위 제1형 신경내분비종양(gastric type I neuroendocrine tumors, gt1NET) 및 위암으로 진행할 가능성이 있다 [4–7].
구강 및 위 미생물군(oral and gastric microbiomes)은 서로 구별되지만 상호 연결된 두 개의 미생물 환경으로, 모두 숙주의 국소적 및 전신적 건강에 영향을 미친다 [8,9]. 구강 세균은 침(saliva)과 함께 위장관으로 이동(translocation)하여 위장관 미생물 환경에 영향을 미치고, 위장관 항상성(homeostasis)에 변화를 일으킬 수 있으며, 염증 및 발암과도 연관될 수 있다 [10]. 구강은 인체 내 주요 세균 저장소 중 하나로, 사람의 구강 환경에 특화되어 적응한 다양한 미생물 군집(consortium of microorganisms)이 존재한다 [11]. 구강 미생물군은 치아 및 치주 질환(dental and periodontal diseases)에 관여하는 것으로 알려져 있다 [12,13]. 또한 최근에는 구강 미생물군과 위장관 질환, 특히 위장관 암 사이의 잠재적 연관성이 제기되고 있다 [14–18]. 더불어 구강질환 또는 치주질환과 위암 간의 연관성도 보고된 바 있다 [19–22].
한편, 위 미생물군(gastric microbiome) 역시 위암을 포함한 다양한 위 질환의 병태생리에 중요한 인자로 부각되고 있다 [8,13,23–25]. 정상 생리 상태에서는 강한 산성의 위내 환경(highly acidic intragastric environment) 때문에 일반 세균이 위 점막에 정착(colonization)하기 어렵다 [2,3]. 역사적으로도 위는 무균 상태(sterile)로 여겨졌으나, 이후 위 점막에서 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori, H. pylori)가 분리되면서 이러한 개념이 바뀌게 되었다 [8,23].
반면, AIG에서는 위내 미세환경(intragastric microenvironment)에 현저한 변화가 발생한다. 즉, 염산 분비 감소와 위 pH 상승이 나타나며, 이는 삼켜진 구강 세균이나 위내 세균의 과증식을 촉진한다. 이러한 변화는 위내 세균 불균형(gastric dysbiosis)을 유발할 수 있으며, 이는 숙주의 염증 반응에 영향을 미치고 위 질환의 발생 과정에 중요한 역할을 할 가능성이 있다. 위내 세균 불균형은 위염이 장상피화생(intestinal metaplasia) 및 위암으로 진행되는 과정에도 관여할 수 있다 [24,26–28].
현재까지의 지식으로는 AIG 환자에서 구강 및 위 미생물군 구성을 동시에 조사한 연구는 부족한 상태이다. 따라서 본 연구의 목적은 AIG 환자(증례군, cases)와 AIG가 없는 환자(대조군, controls)에서 구강 및 위 미생물군의 구성(composition)을 분석하고, 이들 사이의 잠재적인 차이점과 유사점을 평가하는 데 있다.
2. Materials and Methods
2.1. Study Design and Population
본 환자-대조군 연구(case–control study)에서는, 빈혈 또는 소화불량(dyspepsia)으로 인한 AIG의 임상적 의심이 있거나, 이미 진단된 AIG의 내시경 추적 관찰(endoscopic surveillance)을 위해 학술병원(academic hospital)의 전용 소화기내시경 세션에서 위내시경(gastroscopy)이 예정된 연속 환자(consecutive subjects)를 모집하였다(2023년 2월–4월). 각 대상자로부터 위내시경 시행 전 타액 샘플(saliva samples, n = 40)을 수집하였고, 위내시경 중에는 미생물군 분석(microbiota analyses)을 위한 조직 생검(biopsies, n = 40)과 updated Sydney system에 따른 위염의 조직병리학적 평가(histopathological assessment)를 위한 검체를 채취하였다 [29].
포함 기준(inclusion criteria)은 다음과 같았다: 18세 초과, 빈혈 또는 원인 미확인 소화불량(uninvestigated dyspepsia)으로 인해 AIG가 임상적으로 의심되는 경우, 혹은 이미 진단된 AIG 환자에서 내시경 추적 관찰이 필요한 경우였다.
제외 기준(exclusion criteria)은 다음과 같았다: 18세 미만, 불완전한 위내시경(incomplete gastroscopy), 연구 등록 2개월 이내의 급성 위장염(gastroenteritis) 또는 대장염(colitis), 연구 등록 1개월 이내의 proton pump inhibitor, 항생제(antibiotics), 프로바이오틱스(probiotics), 또는 항암화학요법(chemotherapy) 사용, 그리고 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 양성이었다.
각 환자는 임상 설문지(clinical questionnaire)를 작성하였으며, 여기에는 인구학적 정보(demographics), 성별(gender), 국적(nationality), 거주 지역(region of residence), 교육 수준(education level), 고용 상태(employment status), 생활습관 항목(lifestyle items; 흡연, 음주, 신체활동, 식이), 체질량지수(body mass index), 위암 가족력(family history for gastric cancer), 동반질환(comorbidities), 위내시경 시행 사유(reason for gastroscopy), 복용 약물(drugs), 그리고 구강 위생과 관련된 항목들이 포함되었다. 구체적으로는 껌이나 사탕 사용(use of chewing gums or candies), 하루 칫솔질 횟수(daily tooth brushing), 구강세정제 사용(use of mouth-washing), 마지막 구강 위생 관리(last oral hygiene appointment), 마지막 치과 검진(last dental check-up), 가철성 또는 고정성 의치(removable or fixed dentures), 치과 또는 치주 질환의 병력(history of dental or periodontal diseases) 등이 조사되었다.
연구에 등록된 모든 환자는 서면 동의(informed consent)를 제공하였으며, 본 연구는 지역 윤리위원회(local ethical committee)의 승인을 받았다(7295/2022).
2.2. Saliva Sample Collection
포함된 모든 대상자는 예정된 위내시경 전날 전화 연락을 받았으며, 타액 샘플(saliva sample) 채취 방법에 대한 안내를 받았다. 환자들은 채취 당일 아침에 칫솔질을 하거나, 구강세정제(mouthwash)를 사용하거나, 껌 및 사탕(chewing gum/candies)을 섭취하지 않도록 지시받았다. 또한 샘플 채취 당일에는 흡연도 금지되었다.
참가자들은 물로 입안을 헹군 뒤 30분을 기다린 후, DNA-Shield(Zymo Research, Irvine, CA, USA)가 포함된 멸균 튜브(sterile tube)에 타액 샘플을 제공하였다. DNA-Shield는 핵산(nucleic acids)을 안정화시키고 상온에서 미생물의 완전성(microbial integrity)을 보존하는 역할을 한다. 그러나 샘플은 이후 즉시 −20℃에서 냉동 보관되었다.
2.3. Gastric Biopsies
위내시경(gastroscopy) 시행 중, 위 체부 점막(corpus mucosa)에서 채취한 생검 조직 중 첫 번째 검체(one corpus mucosa biopsy, the first one taken)는 미생물군 분석(microbiome analysis)을 위해 멸균 겸자(sterile forceps)를 사용하여 별도로 확보하였다. 해당 조직은 즉시 DNA-Shield가 담긴 Eppendorf 튜브에 넣어졌으며, 곧바로 −20℃에서 보관되었다.
추가적으로 updated Sydney system에 따라 총 5개의 위 생검 조직(gastric biopsies)을 채취하였다. 구체적으로는 전정부(antrum)에서 2개, 위각부(angularis incisura)에서 1개, 체부-기저부(corpus-fundus)에서 2개를 채취하였으며 [30], 이들 검체는 위염의 조직병리학적 평가(histopathological assessment of gastritis)를 위해 제출되었다.
2.4. Histopathological Assessment of Gastritis
위 생검 조직(gastric biopsy samples)은 hematoxylin and eosin(H&E) 염색을 시행한 후, 위 병리(gastric pathology)에 높은 전문성을 가진 병리의사(pathologist)에 의해 평가되었다. 각 검체는 updated Sydney system에 따라 염증(inflammation), 위축(atrophy), 장상피화생(intestinal metaplasia), 그리고 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 감염 여부를 평가하였다 [29].
AIG 진단은 체부선 위축(corpus glandular atrophy), 산분비샘(oxyntic gland) 소실, ECL 세포 과형성(ECL cell hyperplasia), 그리고 가성유문선화생(pseudopyloric metaplasia) 및/또는 장상피화생이 존재하면서, 전정부 점막(antral mucosa)은 보존(spared)된 경우를 기준으로 하였다. 또한 모든 환자에서 항벽세포 자가항체(anti-parietal cell autoantibodies)가 양성이었다 [1,30].
대조군(controls)은 AIG가 없는 대상자로 정의하였으며, 조직학적으로 정상 위 점막(histologically normal gastric mucosa)을 보이거나, 또는 체부의 산분비샘 점막(corpus oxyntic mucosa)은 정상인 상태에서 전정부에 국한된(antral-restricted), 비위축성(non-atrophic), 비활동성(non-active), H. pylori 음성 위염을 가진 경우를 포함하였다.
2.5. DNA Extraction and Sequencing
각 검체(타액 샘플 및 위 생검 조직)는 제조사의 지침(Qiagen, Hilden, Germany)에 따라 QIAmp DNA minikit를 이용하여 DNA 추출을 시행하였다. 추출된 DNA는 Illumina Nextera XT DNA Library Preparation Kit를 사용하여 준비하였으며, Illumina NexteraXT 프로토콜을 따랐다. 구체적으로 DNA 샘플은 효소적 절편화(enzymatic fragmentation), 바코딩(barcoding), 그리고 자기 비드(magnetic beads)를 이용한 정제 과정을 거쳤다.
이후 샘플은 형광 기반의 Qubit 정량 시스템(fluorometric Qubit quantification system; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)을 이용해 정량하였고, 이어서 2200 Tape Station Instrument(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)에 적재하여 4 nM으로 정규화(normalization)하였다. 이후 Illumina MiSeq sequencer와 MiSeq Reagent Kit v3(Illumina Inc., San Diego, CA, USA)를 이용하여 paired-end sequencing을 수행하였다.
생성된 fastq 파일은 METAnnotatorX2 software(version 1.0)를 이용하여 저품질(low-quality) read와 인간(Homo sapiens) 유래 read를 제거하는 필터링 과정을 거쳤으며, 이는 매뉴얼에 보고된 표준 필터링 조건을 따랐다(DOI:10.1128/mSystems.00583-21). 이후 National Center for Biotechnology Information(NCBI)에서 확보한 genome 데이터베이스를 수동으로 선별(manually curated) 및 전처리(pre-processed)한 데이터베이스를 이용하여, 100,000개의 read에 대한 분류학적 분석(taxonomic classification)을 MegaBLAST(PMID: 26250111)로 수행하였다. 전체 분석 과정은 METAnnotatorX2 매뉴얼을 기반으로 하였다 [31,32].
2.6. Statistical Analysis
기술통계(descriptive statistics)는 전체 대상자 수에 대한 빈도와 비율[number (%)] 또는 평균 ± 표준편차(mean ± SD), 혹은 중앙값(범위)[median (range)]로 표현하였다.
알파 다양성(alpha-diversity)은 Shannon–Wiener diversity index를 이용하여 계산하였으며, 이는 상대적 풍부도(relative abundance, evenness)를 고려하여 균종의 풍부성(taxa richness)에 대한 정보를 제공한다.
타액 샘플과 생검 조직 샘플을 각각 분리하여 분석하였으며, Bray–Curtis 비유사성 행렬(Bray–Curtis dissimilarity matrix)을 기반으로 베타 다양성(beta-diversity) 분석을 수행하였다. 결과는 principal coordinates analysis(PCoA)를 이용한 3차원 그래프로 시각화하였으며, 증례군(cases)과 대조군(controls)을 서로 다른 색상으로 표시하였다.
또한 증례군과 대조군 간 세균 종(bacterial species)의 유의한 상관관계를 평가하기 위해 Spearman 상관분석(Spearman correlation analysis)을 시행하였고, 다중 비교 보정을 위해 FDR Benjamini–Hochberg correction을 적용하였다. 마지막으로, 개별 대상자 간 sharing analysis를 수행하여 구강과 위 사이에서 세균 종의 이동 또는 전이(passage/transition)가 존재할 가능성을 평가하였으며, 샘플은 증례군과 대조군으로 구분하여 분석하였다.
독립표본 t검정(independent t-test)은 1000회 bootstrap을 적용하여 SPSS(version 2.0, IBM, www.ibm.com/software/it/analytics/spss; access 15 March 2026)를 사용해 수행하였다. 상관분석(correlation analyses)은 RStudio(RStudio Team, version 2.0; RStudio: Integrated Development for R. RStudio, PBC, Boston, MA, USA; www.rstudio.com)에서 “Hmisc” 및 “corrplot” 패키지를 사용하여 시행하였으며, Pearson 상관행렬(Pearson correlation matrices)을 생성하였다.
사후 검정력 분석(post hoc power analyses)은 alpha-diversity와 세균 풍부도(bacterial abundance)에 대해 유의수준(alpha-level) 0.05에서 수행하였으며, MedCalc® Software Ltd.(Ostend, Belgium, version 22.009)를 사용하였다.
3. Results
포함된 총 40명의 대상자 중, 20명은 조직학적으로 AIG로 진단되어 증례군(cases)으로 분류되었고, 나머지 20명은 정상 위 점막(normal gastric mucosa, n = 18)을 보이거나, 또는 체부 산분비샘 점막(corpus oxyntic mucosa)은 정상인 상태에서 전정부에 국한된(antral-restricted), 비위축성(non-atrophic), 비활동성(non-active), H. pylori 음성 위염(n = 2)을 보여 대조군(controls)으로 분류되었다.
증례군과 대조군의 중앙 연령(median age)은 각각 69세와 58세였으며, 여성 비율은 각각 75%와 45%였다(p > 0.05). 또한 국적(nationality), 거주 지역(region of residence), 교육 수준(education level), 고용 상태(employment status), 생활습관(lifestyle), 그리고 구강 위생 관련 항목(oral hygiene items) 역시 두 군 간 차이가 없었다(Table 1).
AIG 증례군 중에서는 체부 위축(corpus atrophy)이 중증(severe)인 경우가 55%, 중등도(moderate)가 35%, 경도(mild)가 10%였다. 장상피화생(intestinal metaplasia)은 85%에서 관찰되었다. 위 체부의 위축 및 장상피화생의 평균 ± 표준편차(mean ± SD) 중증도 점수(severity score)는 각각 2.4 ± 0.8 및 1.2 ± 0.7이었다. 반면 만성 염증세포 침윤(chronic inflammatory infiltrate)과 활동성 염증세포 침윤(active inflammatory infiltrate)의 중증도 점수는 각각 1.6 ± 0.7 및 0.1 ± 0.3이었다.
Supplementary Table S1에는 증례군과 대조군에서 위 체부 및 전정부 점막의 조직병리학적 변화(histopathological changes)에 대한 상세 평균 중증도 점수가 제시되어 있다.
3.1.Alpha- and Beta-Diversity
알파 다양성(alpha-diversity)은 개별 샘플 내 다양성(diversity within single samples)을 나타내는 기술적 지표로, 필터링 후 분류된 read를 대상으로 Shannon–Wiener index를 이용하여 분석하였다. 이 지표는 종(species) 분포의 풍부도(abundance, evenness)와 균등성(equity)을 함께 고려한다.
필터링 후 분류된 read 수로 표현한 세균 풍부도(bacterial abundance)는, AIG 증례군에서 타액 샘플이 위 생검 조직보다 유의하게 높았다(중앙값, IQR: 27,492 [12,842–39,663] vs. 159 [95–442], p < 0.0001; 평균 ± SD: 27,167 ± 15,472 vs. 325.4 ± 305.3, p < 0.0001). 또한 AIG가 없는 대조군에서도 동일한 경향을 보였다(중앙값, IQR: 25,648 [12,252–42,751] vs. 113 [52–173], p < 0.0001; 평균 ± SD: 30,974 ± 22,654 vs. 160.1 ± 149.7, p < 0.0001).
두 신체 부위(body compartments)에서 증례군과 대조군을 비교한 결과, 위 생검 조직에서의 세균 풍부도는 증례군이 대조군보다 거의 2배 높았으나 통계적 유의성에는 도달하지 못하였다(mean ± SD: 325.4 ± 305.3 vs. 160.1 ± 149.7, p = 0.06, post hoc power = 0.47). 반면, 타액 샘플에서는 증례군과 대조군 간 세균 풍부도 차이가 없었다(mean ± SD: 27,167 ± 15,472 vs. 30,974 ± 22,654, p = 0.54, post hoc power = 0.09) (Supplementary Figure S1).
Figure S1: Comparison of classified reads (bacterial abundance) after % and n° filtering of gastric biopsy (p = 0.06) and saliva (p = 0.54) samples between cases and controls; CA = cases: n = 20 patients with autoimmune atrophic gastritis; CO = n = 20 controls without autoimmune atrophic gastritis.
상대적 풍부도(relative abundance, evenness)를 고려한 균종 풍부성(taxa richness)을 평가하기 위해 Shannon–Wiener diversity index를 계산하였으며, 결과는 Figure 1에 도식화하였다.
Figure 1. Biodiversity and relative abundance (evenness) as calculated by the Shannon–Wiener index in saliva samples (left graph) and gastric biopsies (right graph) of 20 cases (CA) with autoimmune gastritis and 20 controls (CO) without autoimmune gastritis.
위 생검 조직(gastric biopsy samples)에서는 AIG 증례군이 대조군보다 Shannon–Wiener diversity index가 낮았다(2.55 vs. 2.61, p = 0.0014). 이는 증례군에서 생물다양성(biodiversity)과 상대적 풍부도(evenness)가 감소하였음을 의미하며, 세균 불균형(dysbiosis)을 시사한다.
반대로 타액 샘플에서는 AIG 증례군이 대조군보다 Shannon–Wiener diversity index가 더 높았다(2.83 vs. 2.73, p = 0.0000). 이는 증례군에서 생물다양성과 상대적 풍부도가 대조군보다 더 높음을 의미한다.
베타 다양성(beta-diversity)은 두 생태계(ecosystems) 또는 샘플 군(sample groups) 사이의 차이 또는 거리(difference or distance)를 나타내는 지표로, AIG 증례군과 대조군의 타액 및 위 생검 조직 샘플에 대해 Bray–Curtis 비유사성 행렬(Bray–Curtis dissimilarity matrix)을 이용하여 계산하였다. 결과는 3차원 principal coordinates analysis(PCoA)로 시각화하였다.
Figure 2에서 보이는 바와 같이, AIG 증례군과 대조군 간 베타 다양성은 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 이는 타액 샘플(p = 0.591, post hoc power = 0.08)과 위 생검 조직(p = 0.676, post hoc power = 0.06) 모두에서 동일하였다.
즉, 주로 세균의 존재 빈도와 풍부도(abundance)를 기반으로 하는 Bray–Curtis 비유사성 분석에서는, 본 연구 집단에서 증례군과 대조군 간 유의한 차이가 확인되지 않았다.
Figure 2. Beta-diversity analysis (based on Bray–Curtis dissimilarity matrix) of saliva (upper graph) and gastric biopsy (lower graph) of 20 cases with autoimmune gastritis (CA) and 20 controls without (CO) and represented by PCoA (principal coordinates analysis) in 3D. Cases are depicted in red and controls in blue. Beta-diversity between CA and CO was not statistically different, neither in saliva samples (p = 0.591) nor in gastric biopsies (p = 0.676), indicating that Bray–Curtis dissimilarity, mainly based on occurrence data (abundance), did not show significant differences between cases and controls in this specific study population.
3.2.Taxonomy
전체 연구 대상군에서, 유병률(prevalence) 2.5% 이상인 세균 분류군(bacterial taxa)의 총 개수는 타액 샘플에서 위 생검 조직보다 거의 4배 많았다. 즉, 타액 샘플에서는 498종, 위 생검 조직에서는 128종이 확인되었으며, 비율은 3.9:1이었다.
전체 증례군 및 대조군의 타액 샘플에서 17개의 세균 분류군이 100%의 유병률로 확인되었다. 여기에는 Streptococcus oralis, Streptococcus mitis, Streptococcus salivarius, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus infantis, Streptococcus australis 및 Streptococcus unknown species, Rothia mucilaginosa, Rothia dentocariosa 및 Rothia unknown species, Prevotella jejuni 및 Prevotella unknown species, Actinomyces unknown species, Haemophilus parainfluenzae, Veillonella unknown species, Granulicatella unknown species 및 Granulicatella adiacens 등이 포함되었다.
또한 12개의 다른 세균 분류군이 97.5%의 높은 유병률을 보였는데, 여기에는 Prevotella histicola, Prevotella melaninogenica, Prevotella nigrescens, Prevotella intermedia, Prevotella denticola, Streptococcus pseudopneumoniae, Gemella sanguinis, Haemophilus unknown species, Lancefieldella unknown species, Veillonella atypica/rogosae, Veillonella dispar, Veillonella parvula 등이 포함되었다.
위(stomach)에서 가장 흔하게 발견된 상위 5개 세균 분류군은 Cutibacterium acnes(57.5%), Streptococcus salivarius(45%), Streptococcus unknown species(45%), Streptococcus mitis(40%), 그리고 Prevotella unknown species(42.5%)였다. 한편 Actinomyces unknown species, Prevotella melaninogenica, Cutibacterium unknown species의 유병률은 각각 37.5%, 37.5%, 35%로 상대적으로 낮았다.
이후 세균 종 수준(taxonomy level of bacterial species)에서의 차이를 평가하기 위해 Spearman 상관분석(Spearman correlation analysis)을 이용한 변수 간 상관분석(correlation analysis)을 시행하였다.
Table 2에서 나타난 바와 같이, 타액 샘플에서는 AIG 증례군과 Gemella sanguinis 및 Gemella unknown species, Chryseobacterium unknown species, Fusobacterium unknown species, Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium periodonticum, 그리고 Prevotella multisaccharivorax 사이에 유의한 양의 상관관계(significant positive association)가 관찰되었다.
반면 위 생검 조직에서는 AIG 증례군과 Streptococcus oralis, Gemella unknown species, Fusobacterium pseudoperiodonticum, Veillonella rogosae, 그리고 Gemella sanguinis 사이에 유의한 양의 상관관계가 확인되었다.
3.3.Sharing Analysis of Bacterial Taxa Between the ORAL and the Gastric Compartment
구강과 위 사이에서 세균 종(bacterial species)의 잠재적 연관성을 평가하기 위해, 샘플을 증례군(cases)과 대조군(controls)으로 구분한 후, 개별 대상자(single subjects)의 구강 및 위 구획(compartments) 사이에서 공유(shared)되는 세균 종에 대한 분석(sharing analysis)을 수행하였다.
Supplementary Figure S2에는 AIG 증례군과 대조군에서 타액과 위 생검 조직 사이에 공유된 세균 분류군(shared bacterial taxa)이 상세히 제시되어 있다.
Figure S2. Shared bacterial taxa between saliva and gastric biopsies in cases with autoimmune atrophic gastritis and in controls. CA, cases; CO, controls.
Table 3에서 보이는 바와 같이, AIG 증례군에서 가장 흔하게 공유된 세균 분류군은 Streptococcus oralis, Streptococcus mitis, 그리고 Prevotella histicola였다. 주목할 점은 Fusobacterium pseudoperiodonticum, Gemella sanguinis, Gemella unknown species, Veillonella rogosae의 네 가지 세균 분류군은 AIG 증례군에서만 구강과 위 사이에 공유되었고, 대조군에서는 관찰되지 않았다는 점이다. 이는 AIG에서의 비산성(non-acidic) 위내 환경(intragastric microenvironment)에 의해 이러한 세균의 생존 및 정착이 촉진되었을 가능성을 시사한다.
20명의 AIG 증례군 중, 7명(35%)에서는 구강과 위 사이에 공유된 세균이 전혀 없었다. 5명(25%)에서는 1개의 세균 분류군만 공유되었으며, 각각 4명(20%), 2명(10%), 2명(10%)에서는 2개, 3개, 4개의 세균 분류군이 공유되었다.
특히 Gemella sanguinis는 단독으로 공유된 경우는 없었으며, 항상 Streptococcus 또는 Prevotella와 같은 다른 세균 분류군과 함께 동반되어(shared in association) 나타났다(Table 4).
또한 구강과 위 사이의 세균 공유 여부에 따라 AIG 증례군 사이에서 임상적(clinical) 차이(연령, 성별, 임상 증상, 구강 위생)나 조직학적(histological) 차이(체부 위축의 중증도, 장상피화생)는 관찰되지 않았다.
4. Discussion
현재까지 알려진 바에 따르면, 본 연구는 AIG 환자에서 구강 및 위 미생물군의 구성을 동시에 평가한 최초의 연구이다. AIG는 위산 분비 저하와 저산증(hypochlorhydria)을 특징으로 하는 잘 알려진 질환이며, 본 연구에서는 이를 정상적인 위산 분비를 가진 대상자와 비교하였다.
정량적 관점에서 보면, 본 연구 결과는 필터링 후 분류된 read 수(classified reads after filtering)를 기준으로 할 때, AIG 환자와 대조군 모두에서 구강 미생물군(oral microbiota)이 위 미생물군(gastric microbiota)보다 훨씬 풍부하다는 것을 보여주었다(p < 0.0001). 또한 타액 샘플에서 확인된 전체 세균 분류군(bacterial taxa)의 수는 위 점막에서 확인된 수보다 약 4배 많았다(n = 498 vs. 128, ratio 3.9:1). 이는 첫째, 위는 구강보다 미생물 정착(colonization)이 적은 환경이라는 점, 둘째, 대부분 인간 DNA로 구성된 위 생검 조직에서는 세균 DNA의 추출 및 증폭이 기술적으로 더 어렵다는 점 때문으로 해석할 수 있다. 반면 타액은 액체-점성(liquid–viscous) 환경이므로 세균 DNA 추출이 상대적으로 용이하다.
또한 본 연구는 AIG 환자에서 대조군보다 Shannon–Wiener biodiversity index가 낮다는 점을 재확인하였다. 이는 AIG에서 생물다양성(biodiversity)과 상대적 풍부도(relative abundance, evenness)가 감소해 있음을 의미하며, 위내 세균 불균형(gastric dysbiosis)을 시사한다. 이러한 결과는 기존 보고들과도 일치한다 [26,28].
AIG에서 세균 다양성이 감소하는 이유는 만성 염증(chronic inflammation)과 비산성 위내 pH(non-acidic intragastric pH)로 특징지어지는 특수한 위내 환경 때문일 수 있다. 정상적으로 위산은 세균 제거(scavenging) 역할을 수행하지만, AIG에서는 이러한 기능이 저하되어 침과 함께 삼켜진 비정형 위내 세균(non-typical intragastric bacteria), 특히 구강 유래 미생물(oral microbiota-derived bacteria)의 과증식을 촉진할 가능성이 있다 [17,27,28,33–37]. 이 개념은 오래전부터 가설로 제시되어 왔지만, 실제 데이터로 입증되지는 못했다. 본 연구는 구강 및 위 미생물군을 동시에 평가함으로써 이러한 가설을 뒷받침하는 근거를 제공한다.
대조군과 비교했을 때, AIG 환자의 타액에서는 Gemella sanguinis, Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium periodonticum, Fusobacterium unknown species, 그리고 Prevotella multisaccharivorax가 유의하게 증가해 있었다. 반면 위 생검 조직에서는 Streptococcus oralis, Gemella sanguinis, Fusobacterium pseudoperiodonticum, Veillonella rogosae가 유의하게 풍부하였다.
실제로 AIG 환자에서 구강과 위 사이에 가장 흔하게 공유된 세균은 Streptococcus oralis, Streptococcus mitis, Prevotella histicola였으며, Fusobacterium pseudoperiodonticum, Gemella sanguinis 및 Gemella unknown species, Veillonella rogosae는 AIG 환자에서만 구강과 위 사이에 공유되었고 대조군에서는 관찰되지 않았다.
이 결과는 AIG에서 관찰되는 주요 세균들이 구강 기원(oral origin)임을 시사하는 첫 번째 근거라고 할 수 있다. 특히 AIG에서 가장 흔하게 공유된 균종이 Streptococci 및 Prevotellae였고, AIG에서만 구강과 위 사이에 공유된 세균들이 Fusobacterium pseudoperiodonticum, Gemella sanguinis, Veillonella rogosae와 같이 전형적인 구강 상재균(oral cavity colonizers)이었다는 점은 이를 더욱 뒷받침한다.
이러한 현상은 정상적인 위산 분비를 가진 대조군에서는 관찰되지 않았으며, 이는 AIG에서의 위산 분비 저하와 그에 따른 높은 위내 pH, 그리고 만성적으로 염증이 있는 위 점막 환경이 이러한 구강 세균들이 위에 존재할 수 있도록 하는 중요한 조건임을 강하게 시사한다.
특히 Fusobacterium pseudoperiodonticum은 최근 기술된 구강 혐기성 세균(oral anaerobe)으로, 사람의 혀 및 치은연하 치태(subgingival plaque)에서 처음 분리되었으며, 그 기원이 구강이라는 점을 뒷받침한다 [38]. 이 균은 다균종 생물막(multispecies biofilm) 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
한편 Fusobacterium nucleatum에 대한 최근 연구에서는 강산성 환경(pH 1.5)에 대한 높은 저항성이 보고되었는데, 이는 세포막 지질 조성, 특히 erucic acid의 존재와 관련된 것으로 알려져 있다 [39]. 그러나 현재까지 Fusobacterium pseudoperiodonticum에서 동일한 기전이 존재한다는 직접적인 증거는 없다.
Gemella sanguinis는 잘 알려진 핵심 구강 공생균(core oral commensal)이며, 최근 연구들에서도 주로 구강 미생물 환경에 적응된 균으로 확인되었다. 반면 위에서는 중증 위산 장벽 손상(severe impairment of gastric acid barrier)과 같은 병적 상태에서만 관찰된다 [40].
Veillonella rogosae는 구강-위 전이(oral–gastric translocation)를 가장 잘 설명할 수 있는 세균이다. 이 균은 치태(dental plaque)에서 흔히 분리되는 구강 세균이며, 초기 생물막 형성(early biofilm formation)에 관여한다 [41]. 또한 다른 세균이 생성한 lactate를 에너지원으로 사용하고 nitrate를 nitrite로 환원시키는 대사적 특성을 가지고 있어, 구강 세균 군집과 함께 이동할 가능성이 생물학적으로 타당하다.
반면 이러한 세균들에 대해 정상적인 산성 위 환경에서 생존하거나 위산에 저항하는 명확한 기전은 아직 직접적으로 입증되지 않았다. 또한 본 연구는 단면연구(cross-sectional study)이므로, 관찰된 공유 세균들이 실제 전이(translocation)를 의미하는지, 아니면 유사한 선택 압력(selective pressures)에 의해 독립적으로 정착한 것인지는 구분할 수 없다. 따라서 본 연구는 구강 세균과 위 미생물군 간의 연관성(association)은 보여주지만, 위 세균 불균형의 인과관계(causation)를 입증하는 것은 아니다.
AIG와 연관된 이러한 구강 세균들은 위암 및 위암 전구 병변(preneoplastic conditions)과의 관련성 측면에서도 흥미롭다. Pimentel-Nunes 등은 정상 점막, 진행성 위축성 위염 및 장상피화생, 초기 위암 환자의 위 생검 조직에서 full-length 16S rRNA sequencing을 시행한 결과, 모든 단계에서 세균 불균형(dysbiosis)을 관찰하였고, 특히 장상피화생 단계에서 더욱 뚜렷하였다 [42]. 이 연구에서는 Gemella와 Streptococcus가 정상군에서 장상피화생 및 위암으로 갈수록 점진적으로 증가하였다(Gemella: 1.48%→3.9%, p = 0.014; Streptococcus: 19.3%→33.7%, p = 0.04).
또한 Gemella는 위암 환자의 구강 면봉(oral swab) 샘플에서도 증가되어 있었다 [43]. Streptococcus 역시 위암 환자의 구강과 위, 그리고 위암 조직에서 증가되어 있었으며 [37,44], H. pylori 음성 위암 환자에서도 증가가 보고되었다 [45].
구강 세균의 일종인 Fusobacterium 역시 H. pylori 감염 여부와 무관하게 위암 및 그 전구 병변과 연관되어 있다고 알려져 있다 [25,33,46–48]. 구강 내 Fusobacterium은 위축성 위염 및 장상피화생 환자에서 정상 대조군보다 유의하게 증가해 있었으며, 이는 이들 환자에서의 구강 세균 불균형을 시사한다 [17,49]. Fusobacterium nucleatum은 위암 조직 [49,50] 및 위축성 위염 환자의 타액에서 정상인보다 증가되어 있었다 [51].
이러한 데이터와 본 연구 결과를 종합하면, AIG와 같은 저산성 전암성 상태(hypochlorhydric precancerous conditions)에서는 위 세균 불균형이 구강 유래 세균과 연관되어 있으며, 위산 분비 저하 상태에서는 구강 미생물군의 구성이 위 미생물군 구성에 영향을 미칠 수 있음을 강하게 시사한다. 이는 AIG 환자에서 구강 위생(oral hygiene), 치과 건강(dental health), 치주 건강(periodontal health)의 중요성에 대한 관심을 환기시킨다.
저자들은 본 연구의 몇 가지 제한점을 인지하고 있다. 첫째, 총 80개의 샘플(타액 40개, 생검 40개)을 분석하였지만, 특히 하위 분석(sub-analysis)을 수행하기에는 표본 수가 충분하지 않을 수 있으며, 이를 보완하기 위해 post hoc power analysis를 시행하였다.
둘째, 식이(diet)는 미생물군 연구에서 중요한 변수이지만, 본 연구에서는 특별한 식이 조절을 시행하지 않았다. 다만 대상자 중 특수 식이를 하는 경우는 없었고, 모두 항생제, pre-/probiotics, 위산분비억제제 사용을 중단한 상태였다.
셋째, AIG는 위암 위험이 증가된 질환이지만 [6,52], 연구 등록 기간 동안 새롭게 진단된 위암 환자가 없어, 위암을 동반한 AIG 환자에 대한 분석은 수행할 수 없었다.
넷째, 대조군 중 2명은 전정부 국한 비활동성 비위축성 H. pylori 음성 위염을 가지고 있었으나, 이들을 제외한 분석에서도 결과는 변하지 않았다.
다섯째, 본 연구의 단면연구 설계상 구강 세균 불균형이 위 세균 불균형보다 먼저 발생하는지, 혹은 그 반대인지를 판단할 수 없다. 이러한 방향성(directionality)을 규명하기 위해서는 종단연구(longitudinal studies) 또는 기전 연구(mechanistic experiments)가 필요하다.
본 연구의 강점 중 하나는 기존의 16S rRNA sequencing과 달리, 보다 광범위한 세균 및 분류학적 프로파일링(taxonomic profiling)이 가능한 비표적(un-targeted) microbiome sequencing 접근법을 사용하였다는 점이다.
16S rRNA 유전자는 계통발생학적 표지자(phylogenetic marker)로서 비용 효율적이고 효율적인 방법이지만, hypervariable region 선택이나 primer 의존적 PCR 증폭(primer-dependent PCR amplification)과 같은 편향(bias)의 영향을 받을 수 있으며, 이는 미생물 구성 평가(microbial composition assessment)의 변동성을 초래할 수 있다.
반면 shotgun metagenomics는 비용이 많이 들지만, 더 넓은 분류학적 해상도(taxonomic resolution)를 제공하며, 알려지지 않은 세균 종(species) 및 균주(strains)를 탐지할 가능성을 가진다. 다만 그 대가로 더 높은 수준의 생물정보학적 분석 부담(bioinformatic burden)이 요구된다 [53].
결론적으로, 본 연구는 AIG에서 위내 세균 불균형(gastric dysbiosis)의 존재를 재확인하였다. 또한 구강 유래 세균 분류군(oral taxa)이 AIG와 더 흔하게 연관되어 있었으며, 구강과 위 사이에서 공유되는 양상도 관찰되었다. 이러한 결과는 AIG에서 구강 미생물군(oral microbiota)이 위 세균 불균형과 연관되어 있음을 보여주며, 구강 정상 미생물 균형(oral eubiosis)의 중요성에 주목하게 한다.
<Abstract>
Autoimmune gastritis (AIG) in its advanced atrophic stage is characterized by reduced acid secretion, dysbiosis, and gastric cancer (GC) risk. Swallowed oral bacteria surviving in increased intragastric pH may play a carcinogenic role. Oral microbiota was linked to increased GC risk. In AIG, the concomitant assessment of oral and gastric microbiota has not yet been performed. This study aimed to investigate the oral and gastric microbiota in AIG patients to clarify the role of oral bacteria in gastric dysbiosis. A case-control study on n = 20 histologically diagnosed AIG patients and n = 20 controls without AIG is conducted. Saliva samples were obtained from subjects who were fasting and without toothbrushing. Within 1 h, gastroscopy with biopsies (for histopathology and DNA extraction) was performed. Saliva (n = 40) and biopsy (n = 40) samples were frozen at -20 °C. DNA was extracted and prepared; paired-end sequencing was performed (IlluminaMiSeq-sequencer, San Diego, CA, USA). Bacterial abundance in biopsies was higher in AIG than in controls (p = 0.06), but was not different in the saliva (p = 0.54) samples. In biopsies, AIG showed a lower Shannon-Index than controls (p = 0.001). In saliva studies, AIG showed a higher Shannon-Index than controls (p = 0.0). In biopsies, Streptococcus oralis, Fusobacterium pseudoperiodonticum, Veillonella rogosae, and Gemella sanguinis were more frequent in AIG (p < 0.03). The most abundantly shared taxa between saliva and biopsy were S. oralis and Prevotella histicola; Gemella sanguinis, Fusobacterium pseudoperidonticum, and Veillonella rogosae were shared in AIG patients only. This study confirmed gastric dysbiosis in AIG. Oral taxa were more commonly associated with AIG and shared between the mouth and the stomach. In AIG, the oral microbiota is associated with gastric dysbiosis, highlighting the importance of oral eubiosis in patients with impaired gastric acid secretion.
Keywords: autoimmune gastritis; gastric dysbiosis; hypochlorhydria; microbiota.
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