Osmola M, Hémont C, Romańczyk M, Druet A, Chapelle N, Matysiak-Budnik T, Lenti MV, Martin JC.
J Transl Autoimmun. 2025 May 24;10:100294. doi: 10.1016/j.jtauto.2025.100294.
1. Introduction
자가면역 위축성 위염(AIG)은 원인 불명의 면역 매개 질환으로, 위 산 분비 부위(oxyntic mucosa)의 벽세포가 점진적으로 파괴되지만 유문(antrum)은 보존되는 것이 특징이다 [1–3]. 그 결과, 저산증과 내인자의 감소로 인해 철분, 비타민 B12 및 기타 미량 영양소의 흡수 장애가 초래된다 [4–7]. AIG의 유병률은 약 2~4%로 추정되며 [8,9], 고령자와 여성에서 증가한다 [10]. AIG는 종종 자가면역 갑상선염, 제1형 당뇨병 등 다른 자가면역 질환과 동반된다 [11,12]. 특히, AIG는 제1형 위 신경내분비 종양의 발생 위험 증가와 연관되며, 위샘암의 위험 증가와도 관련될 가능성이 있다 [3,13–18]. AIG의 혈청학적 특징으로는 항내인자 항체(AIFA)와 항벽세포 항체(APCA)가 있으며, 연구마다 이들의 진단 정확도는 차이를 보인다 [19,20]. 또한 전체 AIG 환자의 최대 20%에서는 AIFA와 APCA가 모두 음성인 ‘혈청 음성’ 형태가 나타날 수 있다 [21,22]. 이는 AIG에 동반되는 신생물 및 미량 영양소 결핍을 예방하기 위해 보다 개선된 진단 전략이 필요함을 시사한다 [7]. 간접면역형광법(IIF)은 AIG 진단의 표준 방법으로 간주되지만, 여러 혼란 요인이 존재한다 [23]. 또 다른 흔히 사용되는 기술인 면역블롯(immunoblot)은 결과를 반정량적으로만 표현할 수 있다는 한계가 있다 [24]. 반면, 효소면역분석(ELISA)과 같은 자동화된 기술은 향상된 진단 성능을 보여주었다 [20,25]. 최근 도입된 또 다른 자동화 기술인 형광 효소면역분석(FEIA)은 AIG에서 자가항체 검사 접근성을 높였으나, 여전히 혈청학적 검사에 대한 명확한 가이드라인 부재가 주요 제한점으로 남아 있다. 지금까지 AIG에서 다양한 검사법의 진단 성능을 비교한 연구는 일부에 불과하며, 대부분 IIF와 ELISA를 비교했을 뿐, 조직학적 확진을 동반하지 않는 경우가 많았다 [20,25,26]. 이러한 배경을 바탕으로, 본 연구는 조직학적으로 확진된 AIG를 대상으로 다양한 자가항체 검사법(FEIA, 면역블롯, IIF)의 진단 성능을 평가하는 것을 목적으로 하였다.
2. Materials and methods
기존에 진행된 전향적 다기관 단면 연구에 포함되었던 환자들이 바이오뱅크에서 선정되었다 [27]. 간략히 원 연구의 프로토콜은 다음과 같다. (i) 2016년부터 2019년 사이 프랑스 4개 대학병원에서 상부위장관 내시경 검사를 시행받은 환자들이 대상이었다. (ii) 모든 환자에게 시드니 프로토콜에 따라 위 조직검사를 포함한 상부위장관 내시경이 시행되었으며, 유문(antrum)에서 최소 2개, 체부(corpus)에서 최소 2개의 조직이 채취되었다. (iii) 이후 공복 혈액 샘플이 채취되었으며, (iv) 업데이트된 시드니 분류에 따라 위 조직의 병리학적 분석을 통해 위축의 유무, 중등도 및 범위가 평가되었다 [27,28].
AIG는 체부 또는 기저부 점막의 위축 소견을 기준으로 조직학적으로 진단되었으며, 장상피화생이나 ECL(enterochromaffin-like) 세포 증식의 동반 유무와 관계없이 포함되었다. 정상 위점막 또는 비위축성 위염 소견을 보인 환자들은 대조군으로 포함되었다.
총 394명의 환자 중, 33명은 체부와 유문 모두에서 조직이 확보되지 않아 제외되었고, 4명은 초기 검사에서 위샘암이 진단되어 제외되었다. 또한 헬리코박터 파일로리 관련 위염 환자 109명, 비위축성 위염 환자 108명(대조군)과 혈청 샘플이 없는 10명도 제외되었다.
최종적으로 대조군 93명과 AIG 환자 37명이 포함되었으며, 추가로 낭트 대학병원(CHU Nantes)에서 새로 진단된 AIG 환자 13명의 샘플이 연구군에 포함되었다.
혈청 APCA(항벽세포항체) 및 AIFA(항내인자항체)는 각각 BlueDiver 자동장비(Alphadia, 벨기에)와 Phadia™ 250 자동장비(ThermoFisher Scientific, 미국)를 이용한 면역블롯(immunoblot) 및 형광 효소면역분석(FEIA)으로 측정되었으며, 제조사의 프로토콜을 따랐다.
면역블롯법에서는 돼지 위에서 추출한 내인자 및 H+/K+ ATPase를 각각 항원으로 사용하였고, BlueScan과 Dr Dot 소프트웨어(D-Tek, 벨기에)로 결과를 분석하였다. 5 UA 초과를 양성 경계값으로 설정하였으며, 이는 제조사가 제시한 불확실(equivocal) 기준에 해당한다.
FEIA에서는 사람 내인자 및 돼지 위에서 정제된 H+/K+ ATPase를 각각 항원으로 사용하였으며, 7 U/mL 초과를 양성 기준으로 사용하였다. 이 역시 제조사의 불확실 기준에 해당한다.
IIF법은 쥐 조직 절편(Biosystems, 스페인)과 형광 표지된 항인간 면역글로불린(Bio-Rad, 미국)을 이용하여 APCA를 측정하였으며, 1:40 희석 비율로 시작하여 양성 시 1:40에서 1:320까지 단계적으로 추가 희석하였다.
헬리코박터 파일로리 IgG 항체는 ELISA(GastroPanel®, Biohit Oyj)를 통해 분석하였으며, 30 EIU 초과를 양성 기준으로 하였다.
민감도(Se), 특이도(Sp), 양성예측도(PPV), 음성예측도(NPV), 곡선하면적(AUC)을 산출하였고, 수신자조작특성(ROC) 곡선을 통해 임계값을 평가하였다. 검사 간 일치도는 일치율 및 Cohen의 카파(κ) 계수를 사용하여 분석하였고, 스피어만 순위상관검정을 통해 상관관계를 평가하였다. 변동성은 %CV로 확인하였으며, 변수 비교는 카이제곱 검정 및 Mann-Whitney U 검정을 사용하였다. 데이터 시각화는 GraphPad® Prism으로 수행되었다.
본 연구는 헬싱키 선언을 준수하였으며, 2011년 11월 8일 기관윤리위원회 승인을 받았다. 임상시험은 clinicaltrials.gov(NCT02624271)에 등록되었으며, 본 연구로부터 파생된 바이오 샘플은 DC-2011-1399로 등록되었다. 모든 환자로부터 서면 동의서를 받았다.
3. Results
총 50명의 AIG 환자(여성 28명, 남성 22명, 평균 연령 61.0 ± 16.4세)와 93명의 대조군이 포함되었다. 대조군은 정상 위점막을 가진 84명과 비위축성 위염을 가진 9명으로 구성되었으며, 대조군의 성별 분포는 여성 54명, 남성 39명이었고(p = 0.8), 평균 연령은 54.7 ± 14.8세로 두 그룹 간에 유의한 차이는 없었다(p = 0.1). 헬리코박터 파일로리 양성률은 AIG 환자에서 6명(12%), 대조군에서 2명(2.1%)으로 AIG 군에서 유의하게 높았다(p = 0.001). AIG 군과 대조군은 연령 및 성별 분포에서 균형을 이루었으며(p > 0.05), 헬리코박터 파일로리 양성률은 AIG 군에서 더 높았다(p = 0.001). 제조사의 기준 임계값을 바탕으로 분석한 AIFA 및 APCA의 진단 성능은 표 1에 요약되어 있다.
AIFA(항내인자항체) 검사는 높은 특이도(Sp)와 양성예측도(PPV)를 보였다. FEIA의 경우 특이도 100%, 양성예측도 100%, 면역블롯의 경우 특이도 98.9%, 양성예측도 94.1%였다. 반면 민감도(Se)는 낮았으며, FEIA는 38%, 면역블롯은 32%에 불과했다. 수신자조작특성(ROC) 곡선을 기반으로 임계값을 조정한 결과, AIFA-FEIA의 민감도와 음성예측도(NPV)가 각각 50%와 78.6%로 개선되었다(그림 1A, 표 2).
FEIA와 면역블롯 간의 일치도는 매우 우수하였으며, Cohen의 카파 계수는 0.873, 전체 일치율은 97.2%였다(표 1). 또한 AIFA 수치는 두 검사법 간에 유의한 양의 상관관계를 보였다(r = 0.658, p < 0.001, 그림 1B). 특히, FEIA는 면역블롯보다 변동성이 적었으며, FEIA의 변동계수(%CV)는 5.48.5%, 면역블롯은 23.530.6%였다(보조표 1).
APCA(항벽세포항체) 검출율은 모든 방법에서 유사하였으며, 민감도는 약 80% 수준이었다. 그러나 IIF는 가장 높은 특이도를 보였으며, 98.8%였다(표 1). 대조군 중 IIF에서 1명, FEIA에서 4명, 면역블롯에서 10명이 APCA 양성으로 나타났으며, 이들은 대부분 낮은 양성 결과를 보였다. 단, 대조군 1명은 세 가지 검사 모두에서 높은 양성 반응을 보였다. FEIA에서 양성으로 확인된 4명 모두 면역블롯에서도 양성이었다.
또한, 두 가지 방법 모두에서 대조군의 항체 역가는 AIG 환자에 비해 유의하게 낮았다(면역블롯: 대조군 1.4 UA vs AIG 37 UA, FEIA: 대조군 1.7 U/mL vs AIG 59.1 U/mL, p < 0.001)(보조그림 1).
FEIA의 APCA 임계값을 조정한 결과, 민감도를 유지하면서 특이도를 추가로 향상시킬 수 있었다(그림 1C, 표 2).
검사법 간 일치도는 매우 우수하였으며, 카파 계수는 0.882~0.965 범위였다. 또한 유의한 양의 상관관계가 관찰되었다(FEIA와 IIF: r = 0.826, p < 0.001, FEIA와 면역블롯: r = 0.843, p < 0.001, 그림 1D, 1E, 표 1). 변동성 역시 FEIA가 더 낮았으며, FEIA의 변동계수는 5.66.8%, 면역블롯은 18~18.9%였다(보조표 1).
FEIA의 반복 측정 실험에서도 AIFA와 APCA 모두 낮은 변동계수를 보여, 각각 4.2%와 5.1%로 확인되었다.
특히, AIFA와 APCA 중 하나 또는 둘 모두에 대해 FEIA 양성 기준을 적용했을 때 AIG 환자 판별 능력이 크게 향상되었으며, 민감도 90%, 특이도 95.7%, 양성 및 음성예측도 모두 90%를 초과하였다(표 2). 두 항체 모두에서 동시에 양성일 경우 특이도는 100%에 도달하였다.
Fig. 1. Diagnostic performance for (A) anti-intrinsic factor antibodies, (C) anti-parietal cell antibodies with FEIA method. Correlation between different assays for antibody concentration (B, D, E).
Correlation between antibody concentration according to the different assays. Spearman test: B: p < 0.001, r = 0.658, D: p < 0.001, r = 0.826, E: p < 0.001, r = 0.843; APCA, anti-parietal cell antibodies; AIFA, anti-intrinsic factor antibodies; APCA, anti-parietal cell antibodies; IIF, indirect immunofluorescence; FEIA, fluo rescent enzyme immunoassay; AU, arbitrary unit.
4. Discussion
AIG의 혈청학적 진단은 검사 방법의 다양성과 표준화된 가이드라인의 부재로 인해 여전히 어려움을 동반하며, 현재로서는 가용성에 따라 검사법 선택이 결정되는 실정이다. 위벽 H/K ATPase가 APCA(항벽세포항체)의 표적 항원으로 밝혀진 이후, ELISA, 면역블롯, FEIA 등 다양한 면역검사법이 개발되었다. 이러한 자동화 검사법은 IIF(간접면역형광법)의 주요 한계였던 검사자의 숙련도 의존성을 줄였다. 그러나 항원원, 분석 방식, 양성 기준 등의 표준화가 부족해 검사 간 진단 정확도의 차이 및 일치도 저하가 여전히 발생할 수 있다.
본 연구에서는 조직검사로 확진된 AIG 환자군을 대상으로 APCA와 AIFA(항내인자항체)를 병합 분석했을 때, FEIA가 면역블롯 및 IIF보다 우수한 성능을 보였으며, 민감도 90%, 특이도 95.7%를 기록하였다. FEIA는 10% 미만의 낮은 검사 간 변동성과 높은 재현성을 보여주었으며, 주관적인 판독과 세포 고정 상태의 변동에 취약한 IIF에 비해 명확한 장점을 보였다 [29]. 실제 본 연구에서도 IIF에서 8개의 샘플이 이종항체(heterophile antibody)에 의한 비특이적 염색 소견을 보였다.
APCA 검출에 있어서는 IIF가 가장 높은 특이도를 보여 대조군에서 위양성(거짓 양성) 발생이 가장 적었으며, 이는 기존 연구들과 일치하는 결과였다 [23]. FEIA의 APCA 양성 기준을 조정하면 민감도를 유지하면서도 특이도를 개선할 수 있어, 해당 검사법의 진단적 가치가 더욱 향상되었다.
AIFA는 매우 높은 특이도를 보였으나 민감도는 낮았으며(FEIA 38%, 면역블롯 32%), 검사법 간 일치도는 높았으나 면역블롯은 FEIA에 비해 더 큰 검사 간 변동성을 보였다. 이는 면역블롯의 자동화 정도가 FEIA보다 낮은 데 기인하며, 본 연구에서 사용된 BlueDiver 시스템은 세척, 시약 분주 등 일부 과정만 자동화했을 뿐, 샘플 분주는 수작업으로 이루어져 변동성의 원인이 될 수 있었다.
또한 FEIA는 정량적 분석법으로 표준 곡선을 활용하는 반면, 면역블롯은 항원 점(dot)의 색상 강도를 음성 대조군과 육안으로 비교하는 반정량적 분석법으로, 이로 인해 경계값에 해당하는 애매한 결과가 증가하고 민감도 및 특이도에 부정적 영향을 미칠 수 있다. FEIA와 면역블롯 간 AIFA 민감도의 차이는 항원원의 차이도 영향을 미쳤을 가능성이 있다. 면역블롯은 돼지 유래 항원을 사용하는 반면, FEIA는 사람 유전자 재조합 항원을 사용한다.
기존 연구에 따르면 ELISA 기반 APCA 검출은 IIF보다 더 높은 민감도를 보인다 [25]. Lahner 등은 APCA를 ELISA로 측정했을 때 민감도 81%, 특이도 90%를 보고한 바 있다. 본 연구에서는 모든 방법(IIF, 면역블롯, FEIA)에서 APCA의 민감도가 약 80%로 유사했으며, 특이도는 IIF가 98.8%로 가장 높았고, FEIA는 95.7%, 면역블롯은 89.3%였다. AIFA의 경우, 면역블롯은 32%, FEIA는 38%의 민감도를 보여, Lahner 연구에서 ELISA로 측정한 민감도 27%와 유사하였다. 두 연구 모두에서 AIFA의 특이도는 100%로 매우 높았다 [20].
ELISA는 IIF에 비해 우수한 APCA 및 AIFA 검출 성능과 낮은 검사 간 변동성을 보여 대안으로 평가되지만 [25,26], FEIA는 최신 면역효소법으로서 완전 자동화 및 높은 유연성을 제공해 일상적인 진단에 이상적이다. 이전 연구에서도 AIG 항체에 대해 ELISA와 FEIA의 유사한 결과가 보고되었으나 조직학적 확진은 없었다 [26]. 본 연구는 FEIA의 진단 우수성을 조직학적으로 확진된 AIG를 대상으로 확인한 최초의 연구이다.
APCA 및 AIFA의 혈청학적 양성 소견은 AIG의 대표적인 특징이다 [20]. APCA는 AIG 환자의 80%에서 검출되며, 증상이 없는 경우나 향후 AIG 발생을 예측하는 '잠재적 AIG'에서도 발견될 수 있다 [12,25]. AIFA는 AIG 환자의 30~60%에서 관찰되며 매우 높은 특이도를 보인다. 한편, 약 10%의 건강한 사람에서도 APCA가 검출될 수 있는데, 이는 진성 위양성(false positive)으로, 검사법에 따라 발생률 차이가 있을 수 있다 [30].
본 연구의 강점으로는 전향적 다기관 연구 디자인과 AIG의 조직학적 확진을 통한 편향 최소화가 있다. 그러나 AIG 환자 수가 적었고, 대조군에 대해 AIG 외 다른 자가면역 질환 또는 의학적 상태에 대한 정보가 부족해 혼란 변수가 존재할 가능성이 있다. 또한, AIG 군의 헬리코박터 파일로리 감염률이 더 높았으나, 이는 연구 결과에 큰 영향을 미치지 않았을 것으로 판단된다. 일부 환자는 연구 참여 시점에 이미 비타민 B12 보충을 받고 있어, 본 연구에서는 비타민 B12 상태를 분석에 포함하지 않았다. 더불어, 위 조직검사의 채취 및 분류 과정에서 발생할 수 있는 진단 오류 가능성도 고려해야 한다.
본 연구는 FEIA, 면역블롯, IIF를 비교하였으며, 향후 더 많은 자동화 검사법과의 추가 비교가 필요하다.
결론적으로, FEIA는 AIG 진단을 위한 APCA 및 AIFA 검사에서 우수한 정확도를 제공하며, 두 항체를 병합 평가했을 때 가장 높은 진단 성능을 보여, AIG 선별 및 진단을 위한 최적의 임상 적용 가능성이 있다.
<Abstract>
Objective: Autoimmune gastritis (AIG) is an important health problem and a risk factor for gastric neoplasms. This study assessed the diagnostic performance of different assays for anti-parietal cell antibodies (APCA) and anti-intrinsic factor antibodies (AIFA) in patients with histologically confirmed AIG.
Methods: This prospective, multicenter study included 50 AIG patients and 93 controls. The diagnostic performance of fluorescent enzyme immunoassay (FEIA) and immunoblot was evaluated for the detection of both APCA and AIFA, while indirect immunofluorescence (IIF) was assessed for APCA only.
Results: Overall, AIFA detection using FEIA demonstrated slightly better performance (specificity [Sp] 100 %, positive predictive value [PPV] 100 %, negative predictive value [NPV] 75 %) compared to immunoblot (Sp 98.9 %, PPV 94.1 %, NPV 73 %). However, both methods showed low sensitivity (Se): 38 % for FEIA and 32 % for immunoblot. When the FEIA cut-off was adjusted using ROC curve analysis, Se increased to 50 %, while maintaining high Sp (98.9 %). For APCA detection, Se was similar across all methods (∼80 %), but Sp varied: immunoblot showed lower Sp (89.3 %) compared to IIF (98.8 %) and FEIA (95.7 %). PPV was highest for IIF (97.5 %), followed by FEIA (89.9 %) and immunoblot (89.3 %). NPV was lowest for immunoblot (80 %), while IIF and FEIA showed comparable values (89.5 % and 90.9 %, respectively). Adjusting the FEIA cut-off for APCA increased Sp to 98.9 % without reducing Se (76 %). Combining AIFA and APCA testing improved diagnostic performance, yielding a sensitivity of 90 % and specificity of 95.7 %.
Conclusions: FEIA offers superior diagnostic accuracy for APCA and AIFA testing in AIG. The highest diagnostic yield for AIG is observed when both APCA and AIFA are assessed. This approach could be clinically applicable in the screening for AIG and diagnostic process of AIG.
Osmola M, Hémont C, Romańczyk M, Druet A, Chapelle N, Matysiak-Budnik T, Lenti MV, Martin JC.
J Transl Autoimmun. 2025 May 24;10:100294. doi: 10.1016/j.jtauto.2025.100294.
1. Introduction
자가면역 위축성 위염(AIG)은 원인 불명의 면역 매개 질환으로, 위 산 분비 부위(oxyntic mucosa)의 벽세포가 점진적으로 파괴되지만 유문(antrum)은 보존되는 것이 특징이다 [1–3]. 그 결과, 저산증과 내인자의 감소로 인해 철분, 비타민 B12 및 기타 미량 영양소의 흡수 장애가 초래된다 [4–7]. AIG의 유병률은 약 2~4%로 추정되며 [8,9], 고령자와 여성에서 증가한다 [10]. AIG는 종종 자가면역 갑상선염, 제1형 당뇨병 등 다른 자가면역 질환과 동반된다 [11,12]. 특히, AIG는 제1형 위 신경내분비 종양의 발생 위험 증가와 연관되며, 위샘암의 위험 증가와도 관련될 가능성이 있다 [3,13–18]. AIG의 혈청학적 특징으로는 항내인자 항체(AIFA)와 항벽세포 항체(APCA)가 있으며, 연구마다 이들의 진단 정확도는 차이를 보인다 [19,20]. 또한 전체 AIG 환자의 최대 20%에서는 AIFA와 APCA가 모두 음성인 ‘혈청 음성’ 형태가 나타날 수 있다 [21,22]. 이는 AIG에 동반되는 신생물 및 미량 영양소 결핍을 예방하기 위해 보다 개선된 진단 전략이 필요함을 시사한다 [7]. 간접면역형광법(IIF)은 AIG 진단의 표준 방법으로 간주되지만, 여러 혼란 요인이 존재한다 [23]. 또 다른 흔히 사용되는 기술인 면역블롯(immunoblot)은 결과를 반정량적으로만 표현할 수 있다는 한계가 있다 [24]. 반면, 효소면역분석(ELISA)과 같은 자동화된 기술은 향상된 진단 성능을 보여주었다 [20,25]. 최근 도입된 또 다른 자동화 기술인 형광 효소면역분석(FEIA)은 AIG에서 자가항체 검사 접근성을 높였으나, 여전히 혈청학적 검사에 대한 명확한 가이드라인 부재가 주요 제한점으로 남아 있다. 지금까지 AIG에서 다양한 검사법의 진단 성능을 비교한 연구는 일부에 불과하며, 대부분 IIF와 ELISA를 비교했을 뿐, 조직학적 확진을 동반하지 않는 경우가 많았다 [20,25,26]. 이러한 배경을 바탕으로, 본 연구는 조직학적으로 확진된 AIG를 대상으로 다양한 자가항체 검사법(FEIA, 면역블롯, IIF)의 진단 성능을 평가하는 것을 목적으로 하였다.
2. Materials and methods
기존에 진행된 전향적 다기관 단면 연구에 포함되었던 환자들이 바이오뱅크에서 선정되었다 [27]. 간략히 원 연구의 프로토콜은 다음과 같다. (i) 2016년부터 2019년 사이 프랑스 4개 대학병원에서 상부위장관 내시경 검사를 시행받은 환자들이 대상이었다. (ii) 모든 환자에게 시드니 프로토콜에 따라 위 조직검사를 포함한 상부위장관 내시경이 시행되었으며, 유문(antrum)에서 최소 2개, 체부(corpus)에서 최소 2개의 조직이 채취되었다. (iii) 이후 공복 혈액 샘플이 채취되었으며, (iv) 업데이트된 시드니 분류에 따라 위 조직의 병리학적 분석을 통해 위축의 유무, 중등도 및 범위가 평가되었다 [27,28].
AIG는 체부 또는 기저부 점막의 위축 소견을 기준으로 조직학적으로 진단되었으며, 장상피화생이나 ECL(enterochromaffin-like) 세포 증식의 동반 유무와 관계없이 포함되었다. 정상 위점막 또는 비위축성 위염 소견을 보인 환자들은 대조군으로 포함되었다.
총 394명의 환자 중, 33명은 체부와 유문 모두에서 조직이 확보되지 않아 제외되었고, 4명은 초기 검사에서 위샘암이 진단되어 제외되었다. 또한 헬리코박터 파일로리 관련 위염 환자 109명, 비위축성 위염 환자 108명(대조군)과 혈청 샘플이 없는 10명도 제외되었다.
최종적으로 대조군 93명과 AIG 환자 37명이 포함되었으며, 추가로 낭트 대학병원(CHU Nantes)에서 새로 진단된 AIG 환자 13명의 샘플이 연구군에 포함되었다.
혈청 APCA(항벽세포항체) 및 AIFA(항내인자항체)는 각각 BlueDiver 자동장비(Alphadia, 벨기에)와 Phadia™ 250 자동장비(ThermoFisher Scientific, 미국)를 이용한 면역블롯(immunoblot) 및 형광 효소면역분석(FEIA)으로 측정되었으며, 제조사의 프로토콜을 따랐다.
면역블롯법에서는 돼지 위에서 추출한 내인자 및 H+/K+ ATPase를 각각 항원으로 사용하였고, BlueScan과 Dr Dot 소프트웨어(D-Tek, 벨기에)로 결과를 분석하였다. 5 UA 초과를 양성 경계값으로 설정하였으며, 이는 제조사가 제시한 불확실(equivocal) 기준에 해당한다.
FEIA에서는 사람 내인자 및 돼지 위에서 정제된 H+/K+ ATPase를 각각 항원으로 사용하였으며, 7 U/mL 초과를 양성 기준으로 사용하였다. 이 역시 제조사의 불확실 기준에 해당한다.
IIF법은 쥐 조직 절편(Biosystems, 스페인)과 형광 표지된 항인간 면역글로불린(Bio-Rad, 미국)을 이용하여 APCA를 측정하였으며, 1:40 희석 비율로 시작하여 양성 시 1:40에서 1:320까지 단계적으로 추가 희석하였다.
헬리코박터 파일로리 IgG 항체는 ELISA(GastroPanel®, Biohit Oyj)를 통해 분석하였으며, 30 EIU 초과를 양성 기준으로 하였다.
민감도(Se), 특이도(Sp), 양성예측도(PPV), 음성예측도(NPV), 곡선하면적(AUC)을 산출하였고, 수신자조작특성(ROC) 곡선을 통해 임계값을 평가하였다. 검사 간 일치도는 일치율 및 Cohen의 카파(κ) 계수를 사용하여 분석하였고, 스피어만 순위상관검정을 통해 상관관계를 평가하였다. 변동성은 %CV로 확인하였으며, 변수 비교는 카이제곱 검정 및 Mann-Whitney U 검정을 사용하였다. 데이터 시각화는 GraphPad® Prism으로 수행되었다.
본 연구는 헬싱키 선언을 준수하였으며, 2011년 11월 8일 기관윤리위원회 승인을 받았다. 임상시험은 clinicaltrials.gov(NCT02624271)에 등록되었으며, 본 연구로부터 파생된 바이오 샘플은 DC-2011-1399로 등록되었다. 모든 환자로부터 서면 동의서를 받았다.
3. Results
총 50명의 AIG 환자(여성 28명, 남성 22명, 평균 연령 61.0 ± 16.4세)와 93명의 대조군이 포함되었다. 대조군은 정상 위점막을 가진 84명과 비위축성 위염을 가진 9명으로 구성되었으며, 대조군의 성별 분포는 여성 54명, 남성 39명이었고(p = 0.8), 평균 연령은 54.7 ± 14.8세로 두 그룹 간에 유의한 차이는 없었다(p = 0.1). 헬리코박터 파일로리 양성률은 AIG 환자에서 6명(12%), 대조군에서 2명(2.1%)으로 AIG 군에서 유의하게 높았다(p = 0.001). AIG 군과 대조군은 연령 및 성별 분포에서 균형을 이루었으며(p > 0.05), 헬리코박터 파일로리 양성률은 AIG 군에서 더 높았다(p = 0.001). 제조사의 기준 임계값을 바탕으로 분석한 AIFA 및 APCA의 진단 성능은 표 1에 요약되어 있다.
AIFA(항내인자항체) 검사는 높은 특이도(Sp)와 양성예측도(PPV)를 보였다. FEIA의 경우 특이도 100%, 양성예측도 100%, 면역블롯의 경우 특이도 98.9%, 양성예측도 94.1%였다. 반면 민감도(Se)는 낮았으며, FEIA는 38%, 면역블롯은 32%에 불과했다. 수신자조작특성(ROC) 곡선을 기반으로 임계값을 조정한 결과, AIFA-FEIA의 민감도와 음성예측도(NPV)가 각각 50%와 78.6%로 개선되었다(그림 1A, 표 2).
FEIA와 면역블롯 간의 일치도는 매우 우수하였으며, Cohen의 카파 계수는 0.873, 전체 일치율은 97.2%였다(표 1). 또한 AIFA 수치는 두 검사법 간에 유의한 양의 상관관계를 보였다(r = 0.658, p < 0.001, 그림 1B). 특히, FEIA는 면역블롯보다 변동성이 적었으며, FEIA의 변동계수(%CV)는 5.48.5%, 면역블롯은 23.530.6%였다(보조표 1).
APCA(항벽세포항체) 검출율은 모든 방법에서 유사하였으며, 민감도는 약 80% 수준이었다. 그러나 IIF는 가장 높은 특이도를 보였으며, 98.8%였다(표 1). 대조군 중 IIF에서 1명, FEIA에서 4명, 면역블롯에서 10명이 APCA 양성으로 나타났으며, 이들은 대부분 낮은 양성 결과를 보였다. 단, 대조군 1명은 세 가지 검사 모두에서 높은 양성 반응을 보였다. FEIA에서 양성으로 확인된 4명 모두 면역블롯에서도 양성이었다.
또한, 두 가지 방법 모두에서 대조군의 항체 역가는 AIG 환자에 비해 유의하게 낮았다(면역블롯: 대조군 1.4 UA vs AIG 37 UA, FEIA: 대조군 1.7 U/mL vs AIG 59.1 U/mL, p < 0.001)(보조그림 1).
FEIA의 APCA 임계값을 조정한 결과, 민감도를 유지하면서 특이도를 추가로 향상시킬 수 있었다(그림 1C, 표 2).
검사법 간 일치도는 매우 우수하였으며, 카파 계수는 0.882~0.965 범위였다. 또한 유의한 양의 상관관계가 관찰되었다(FEIA와 IIF: r = 0.826, p < 0.001, FEIA와 면역블롯: r = 0.843, p < 0.001, 그림 1D, 1E, 표 1). 변동성 역시 FEIA가 더 낮았으며, FEIA의 변동계수는 5.66.8%, 면역블롯은 18~18.9%였다(보조표 1).
FEIA의 반복 측정 실험에서도 AIFA와 APCA 모두 낮은 변동계수를 보여, 각각 4.2%와 5.1%로 확인되었다.
특히, AIFA와 APCA 중 하나 또는 둘 모두에 대해 FEIA 양성 기준을 적용했을 때 AIG 환자 판별 능력이 크게 향상되었으며, 민감도 90%, 특이도 95.7%, 양성 및 음성예측도 모두 90%를 초과하였다(표 2). 두 항체 모두에서 동시에 양성일 경우 특이도는 100%에 도달하였다.
Fig. 1. Diagnostic performance for (A) anti-intrinsic factor antibodies, (C) anti-parietal cell antibodies with FEIA method. Correlation between different assays for antibody concentration (B, D, E).
Correlation between antibody concentration according to the different assays. Spearman test: B: p < 0.001, r = 0.658, D: p < 0.001, r = 0.826, E: p < 0.001, r = 0.843; APCA, anti-parietal cell antibodies; AIFA, anti-intrinsic factor antibodies; APCA, anti-parietal cell antibodies; IIF, indirect immunofluorescence; FEIA, fluo rescent enzyme immunoassay; AU, arbitrary unit.
4. Discussion
AIG의 혈청학적 진단은 검사 방법의 다양성과 표준화된 가이드라인의 부재로 인해 여전히 어려움을 동반하며, 현재로서는 가용성에 따라 검사법 선택이 결정되는 실정이다. 위벽 H/K ATPase가 APCA(항벽세포항체)의 표적 항원으로 밝혀진 이후, ELISA, 면역블롯, FEIA 등 다양한 면역검사법이 개발되었다. 이러한 자동화 검사법은 IIF(간접면역형광법)의 주요 한계였던 검사자의 숙련도 의존성을 줄였다. 그러나 항원원, 분석 방식, 양성 기준 등의 표준화가 부족해 검사 간 진단 정확도의 차이 및 일치도 저하가 여전히 발생할 수 있다.
본 연구에서는 조직검사로 확진된 AIG 환자군을 대상으로 APCA와 AIFA(항내인자항체)를 병합 분석했을 때, FEIA가 면역블롯 및 IIF보다 우수한 성능을 보였으며, 민감도 90%, 특이도 95.7%를 기록하였다. FEIA는 10% 미만의 낮은 검사 간 변동성과 높은 재현성을 보여주었으며, 주관적인 판독과 세포 고정 상태의 변동에 취약한 IIF에 비해 명확한 장점을 보였다 [29]. 실제 본 연구에서도 IIF에서 8개의 샘플이 이종항체(heterophile antibody)에 의한 비특이적 염색 소견을 보였다.
APCA 검출에 있어서는 IIF가 가장 높은 특이도를 보여 대조군에서 위양성(거짓 양성) 발생이 가장 적었으며, 이는 기존 연구들과 일치하는 결과였다 [23]. FEIA의 APCA 양성 기준을 조정하면 민감도를 유지하면서도 특이도를 개선할 수 있어, 해당 검사법의 진단적 가치가 더욱 향상되었다.
AIFA는 매우 높은 특이도를 보였으나 민감도는 낮았으며(FEIA 38%, 면역블롯 32%), 검사법 간 일치도는 높았으나 면역블롯은 FEIA에 비해 더 큰 검사 간 변동성을 보였다. 이는 면역블롯의 자동화 정도가 FEIA보다 낮은 데 기인하며, 본 연구에서 사용된 BlueDiver 시스템은 세척, 시약 분주 등 일부 과정만 자동화했을 뿐, 샘플 분주는 수작업으로 이루어져 변동성의 원인이 될 수 있었다.
또한 FEIA는 정량적 분석법으로 표준 곡선을 활용하는 반면, 면역블롯은 항원 점(dot)의 색상 강도를 음성 대조군과 육안으로 비교하는 반정량적 분석법으로, 이로 인해 경계값에 해당하는 애매한 결과가 증가하고 민감도 및 특이도에 부정적 영향을 미칠 수 있다. FEIA와 면역블롯 간 AIFA 민감도의 차이는 항원원의 차이도 영향을 미쳤을 가능성이 있다. 면역블롯은 돼지 유래 항원을 사용하는 반면, FEIA는 사람 유전자 재조합 항원을 사용한다.
기존 연구에 따르면 ELISA 기반 APCA 검출은 IIF보다 더 높은 민감도를 보인다 [25]. Lahner 등은 APCA를 ELISA로 측정했을 때 민감도 81%, 특이도 90%를 보고한 바 있다. 본 연구에서는 모든 방법(IIF, 면역블롯, FEIA)에서 APCA의 민감도가 약 80%로 유사했으며, 특이도는 IIF가 98.8%로 가장 높았고, FEIA는 95.7%, 면역블롯은 89.3%였다. AIFA의 경우, 면역블롯은 32%, FEIA는 38%의 민감도를 보여, Lahner 연구에서 ELISA로 측정한 민감도 27%와 유사하였다. 두 연구 모두에서 AIFA의 특이도는 100%로 매우 높았다 [20].
ELISA는 IIF에 비해 우수한 APCA 및 AIFA 검출 성능과 낮은 검사 간 변동성을 보여 대안으로 평가되지만 [25,26], FEIA는 최신 면역효소법으로서 완전 자동화 및 높은 유연성을 제공해 일상적인 진단에 이상적이다. 이전 연구에서도 AIG 항체에 대해 ELISA와 FEIA의 유사한 결과가 보고되었으나 조직학적 확진은 없었다 [26]. 본 연구는 FEIA의 진단 우수성을 조직학적으로 확진된 AIG를 대상으로 확인한 최초의 연구이다.
APCA 및 AIFA의 혈청학적 양성 소견은 AIG의 대표적인 특징이다 [20]. APCA는 AIG 환자의 80%에서 검출되며, 증상이 없는 경우나 향후 AIG 발생을 예측하는 '잠재적 AIG'에서도 발견될 수 있다 [12,25]. AIFA는 AIG 환자의 30~60%에서 관찰되며 매우 높은 특이도를 보인다. 한편, 약 10%의 건강한 사람에서도 APCA가 검출될 수 있는데, 이는 진성 위양성(false positive)으로, 검사법에 따라 발생률 차이가 있을 수 있다 [30].
본 연구의 강점으로는 전향적 다기관 연구 디자인과 AIG의 조직학적 확진을 통한 편향 최소화가 있다. 그러나 AIG 환자 수가 적었고, 대조군에 대해 AIG 외 다른 자가면역 질환 또는 의학적 상태에 대한 정보가 부족해 혼란 변수가 존재할 가능성이 있다. 또한, AIG 군의 헬리코박터 파일로리 감염률이 더 높았으나, 이는 연구 결과에 큰 영향을 미치지 않았을 것으로 판단된다. 일부 환자는 연구 참여 시점에 이미 비타민 B12 보충을 받고 있어, 본 연구에서는 비타민 B12 상태를 분석에 포함하지 않았다. 더불어, 위 조직검사의 채취 및 분류 과정에서 발생할 수 있는 진단 오류 가능성도 고려해야 한다.
본 연구는 FEIA, 면역블롯, IIF를 비교하였으며, 향후 더 많은 자동화 검사법과의 추가 비교가 필요하다.
결론적으로, FEIA는 AIG 진단을 위한 APCA 및 AIFA 검사에서 우수한 정확도를 제공하며, 두 항체를 병합 평가했을 때 가장 높은 진단 성능을 보여, AIG 선별 및 진단을 위한 최적의 임상 적용 가능성이 있다.
<Abstract>
Objective: Autoimmune gastritis (AIG) is an important health problem and a risk factor for gastric neoplasms. This study assessed the diagnostic performance of different assays for anti-parietal cell antibodies (APCA) and anti-intrinsic factor antibodies (AIFA) in patients with histologically confirmed AIG.
Methods: This prospective, multicenter study included 50 AIG patients and 93 controls. The diagnostic performance of fluorescent enzyme immunoassay (FEIA) and immunoblot was evaluated for the detection of both APCA and AIFA, while indirect immunofluorescence (IIF) was assessed for APCA only.
Results: Overall, AIFA detection using FEIA demonstrated slightly better performance (specificity [Sp] 100 %, positive predictive value [PPV] 100 %, negative predictive value [NPV] 75 %) compared to immunoblot (Sp 98.9 %, PPV 94.1 %, NPV 73 %). However, both methods showed low sensitivity (Se): 38 % for FEIA and 32 % for immunoblot. When the FEIA cut-off was adjusted using ROC curve analysis, Se increased to 50 %, while maintaining high Sp (98.9 %). For APCA detection, Se was similar across all methods (∼80 %), but Sp varied: immunoblot showed lower Sp (89.3 %) compared to IIF (98.8 %) and FEIA (95.7 %). PPV was highest for IIF (97.5 %), followed by FEIA (89.9 %) and immunoblot (89.3 %). NPV was lowest for immunoblot (80 %), while IIF and FEIA showed comparable values (89.5 % and 90.9 %, respectively). Adjusting the FEIA cut-off for APCA increased Sp to 98.9 % without reducing Se (76 %). Combining AIFA and APCA testing improved diagnostic performance, yielding a sensitivity of 90 % and specificity of 95.7 %.
Conclusions: FEIA offers superior diagnostic accuracy for APCA and AIFA testing in AIG. The highest diagnostic yield for AIG is observed when both APCA and AIFA are assessed. This approach could be clinically applicable in the screening for AIG and diagnostic process of AIG.