Microorganisms. 2023 Jul 29;11(8):1938. doi: 10.3390/microorganisms11081938
최근 gender 및 microbiota 에 대한 관심이 높습니다. AIG 환자에서 Gender와 microbiota 관련 논문이 최근 발표되어 정리해 보겠습니다.
* 알파다양성: 미생물 무리 자체의 다양성 (얼마나 많은 수의 미생물이 있는지 (richness)와 얼마나 고르게 분포되어 있는지 (evenness))
* 베타다양성: 미생물 무리 구성이 대조군의 미생물 무리 구성과 어떻게 다른가에 대한 내용 (상대적인 값)
1. Introduction
최근 임상적 분야, 특히 자가면역질환에서 gender 간의 차이에 대해 지속적인 관심이 증가되고 있습니다. AIG(AAG로 표현함)를 포함한 자가면역질환의 prevalence, severity 그리고 natural history에 대해 gender는 중요한 역할을 갖습니다. 몇몇 질환에서는 gender specific sex hormones, 면역 반응에 대한 gender-sex differences, gender-related organ의 취약성 사이에서 gender differences를 보이고 있습니다. 또한, 인간의 microbiota는 매우 흥미로운 주제로 과학계 에서는 많은 관심을 받고 있습니다. 앞선 연구에서 AIG는 oxyntic mucosa atrophy와 impaired gastric acid secretion으로 인한 hypochlorhydria는 intragastric bacteria의 과 증식이 이루어 질 수 있어서 gastric microbiota의 구성에 영향을 미칠 수 있습니다. 어떤 연구에서는 gender에 의한 질환에 잠재적인 영향을 미치는 것으로 장내 microbiota가 역할을 할 것이라고도 하였습니다. 이번 연구는, 건강한 stoamch과 AIG 환자에서 gastric microbiota의 구성이 gender에 따라 차이가 있는지를 조사하는 것입니다.
<원본 번역>
자가면역 위축성 위염(Autoimmune atrophic gastritis, AAG)은 만성 염증성 질환으로, 위의 산 분비 세포인 옥신틱 점막(oxyntic mucosa)의 위축, 위산 및 내인자의 분비 감소를 유발하며, 벽세포(parietal cell) 및/또는 내인자에 대한 자가항체가 자주 양성으로 나타나는 것이 특징입니다 [1]. 또한 AAG에서는 펩시노겐 I 수치가 낮고 고가스트린혈증(hypergastrinemia)이 흔히 동반되며, 이들은 위 점막 손상 및 위축의 생체표지자로 간주됩니다 [2]. AAG의 정확한 발병 기전은 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 옥신틱 점막의 자가면역적 파괴를 유발하는 주요 작용세포는 자가반응성 T세포로 알려져 있으나, 이들의 유발 인자는 명확하지 않으며, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)가 항원 교차반응(antigen cross-reactivity)을 통해 일정한 역할을 할 가능성이 제기되어 왔습니다 [3].
AAG의 가장 초기 생화학적 증상은 거대적아구성 빈혈(pernicious anemia) 또는 소적혈구성 빈혈(microcytic anemia)로, 각각 코발라민(비타민 B12) 또는 철 결핍으로 인해 발생합니다. 환자의 약 절반에서는 소화불량, 명치통증(epigastric pain), 식후 포만감, 그리고 역류 질환 등의 증상이 나타날 수 있습니다 [4]. AAG는 위 이형성(dysplasia) 및 선암(adenocarcinoma), 그리고 제1형 신경내분비종양(type I neuroendocrine tumors)으로 진행할 수 있는 전암성 질환(pre-neoplastic condition)으로 간주되어야 합니다 [1,5][6–8]. 또한 AAG는 다른 자가면역 질환, 특히 자가면역 갑상샘 질환(예: 하시모토 갑상샘염)이나 제1형 당뇨병과 자주 동반됩니다 [9,10].
최근 몇 년 사이, 성별 및 생물학적 성(sex) 차이에 관한 관심이 다양한 임상 분야, 특히 자가면역 질환에서 증가하고 있습니다. 성별은 AAG와 같은 자가면역 질환의 유병률, 중증도 및 자연 경과 전반에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 성별 차이에 대한 가능한 설명으로는 성별 특이적인 성호르몬, 면역 반응에서의 성 차이, 그리고 성별에 따른 장기 취약성 등이 있습니다 [11,12].
또한, 인간 마이크로바이오타(microbiota)에 대한 과학계의 관심이 크게 증가하고 있습니다. 이전 연구들에서는 AAG가 위 마이크로바이오타 구성의 변화와 관련이 있을 수 있다고 보고하였습니다. 실제로 AAG에서 옥시닉 점막의 위축과 위산 분비 저하로 인해 위 내 세균 증식이 촉진될 수 있는 환경이 조성됩니다 [13–15]. 일부 연구에서는 장내 마이크로바이오타가 질병에 대한 성별 감수성에 영향을 줄 수 있는 가능성도 제기하였습니다 [16]. 그러나 현재까지 위 마이크로바이오타의 성별 차이에 대한 자료는 부족한 실정입니다.
따라서 본 연구에서는 건강한 위를 가진 사람들과 AAG 환자들을 대상으로 위 마이크로바이오타 구성에서의 성별 차이를 조사하고자 하였습니다.
2. Materials and Methods
- H. pylori 양성 환자는 연구에서 배제 하였습니다.
- 52 adult subjects (median age 61 years, range 18–83, 32 females and 20 males)
- 항생제, 위산분비억제제 등은 최소 3주 이상 끊었으며, 모든 환자에서 식단의 제한을 두지는 않았습니다.
- Gastric biopsy: update Sydney system
- 30 subjects (57.7%): healthy stomachs vs. 22 (42.3%) patients: H. pylori-negative AAG (Table 1)
Table 1. Main clinical characteristics of the included subjects with healthy stomachs and autoimmune atrophic gastritis (AAG).
2.1. Gastric Biopsy Sampling
- Genomic DNA extraction과 16SrRNA gene sequencing을 위해서 antrum과 body에서 각각 1개 씩 additional biopsies와 조직학적 평가를 시행하였습니다.
- Gastric microbiota assessment 를 위한 sample은 GC side의 조직검사를 수행한 바로 인접한 부위에서 얻었습니다.
2.2. Bacterial Microbiota Identification by 16SrRNA Gene Sequencing and Data Analysis
- Genomic DNA extraction: PureLink™ Microbiome DNA Purification Kit
- DNA library: Ion16S™ Metagenomics Kit (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) (primer sets V2-4-8 and V3-6,7-9)
- Template preparation and chip loading: IonS5 Ion Chef™ System / Sequencing: IonS5 System
- Fastq files: using a custom script based on the QIIME2 software
- Quality control: sequences with a length between 140 and 400 bp and a mean sequence quality score > 20
(sequences with homopolymers >7 bp and mismatched primers는 생략)
- 16SrRNA Operational Taxonomic Units (OTUs): diversity measures (alpha and beta diversity)
- Bacterial profiles: phylum & genus levels (only taxa with relative abundance > 0.5%)
- Biodiversity (alpha diversity): Box-and-whisker plots (calculated as Shannon-diversity index-H)
2.3. Statistical Analyses
- To compare the abundance and diversity of bacterial genera between groups: Mann–Whitney test
- To compare biodiversity (Shannon index): Student’s t-test
- Beta-diversity in female and male subjects with healthy stomachs and patients with AAG: Permanova
- Principal Coordinates Analysis (PCoA) 3D representation of beta-diversity of bacterial genera abundance (Bray-Curtis matrix): Origin Pro 2023
- Average relative abundance of all OTUs with >50% prevalence in female or male subgroups: Lda Effective Size (LEfSe) analysis
- Heatmap based on the average relative abundance of all genera that showed a prevalence score > 50% between at least one of the male and female subgroups of samples.
3. Results
3.1. Gastric Bacterial Abundance
* Gastric abundance & composition of bacterial genera (Figure 1)
- Healthy stomachs and AIG patients: p = 0.005, R2 0.03733
- Females and males of healthy subjects and AIG patients: p = 0.014, R2 0.02797
건강한 위를 가진 사람들과 자가면역성 위염(AAG) 환자들 간의 위 내 세균 속(bacterial genera)의 풍부도(abundance)와 조성(composition)은 유의하게 다른 것으로 확인되었습니다(p = 0.005, R² = 0.03733). 또한, 건강한 대상자들과 자가면역성 위염 환자들 사이에서 남성과 여성 간의 위 내 세균 풍부도와 조성 역시 유의한 차이를 보였습니다(p = 0.014, R² = 0.02797). 이는 건강한 위를 가진 남녀와 AAG 환자인 남녀의 군집이 각각 분리되어 나타나는 PCoA 3차원(3D) 시각화에서도 확인할 수 있습니다(Figure 1 참조).
Figure 1. 3D Principal Coordinate Analysis of beta-diversity of bacterial genera abundance based on Bray–Curtis matrix of subjects with healthy stomachs and patients with autoimmune atrophic gastritis subdivided by gender (red spheres = females, blue spheres = males, p < 0.05). x,y,z-axis PC1, PC2, PC3.
* Gastric bacterial abundance (Table 2)
- Healthy stomachs: Females >> Males (23,333 reads만 빼고)
- AIG patients: Females ≃ Males
표 2에서 볼 수 있듯이, 건강한 위를 가진 대상자들 중 여성은 남성보다 위 내 세균 풍부도가 더 높았으며, 23,333 리드를 제외한 모든 리드 수에서 통계적으로 유의한 차이를 보였습니다. 반면, 자가면역성 위염(AAG) 환자들의 경우, 모든 리드 수에서 남녀 간 위 내 세균 풍부도가 유사하게 나타났습니다.
Table 2. Comparison of OTUs at different reads between male and female subjects with healthy stomachs and autoimmune atrophic gastritis.
* OTUs (13,333 reads, Figure 2)
- Healthy stomachs: Female 704.6 (284.1–1145.0) vs. Male 470.4 (159.6–1116.6) (p = 0.03, 통계적 차이가 가장 큼)
- AIG patientes: Female 467.2 (174.6–1042.2) vs. Male 433.0 (160.6–560.5) (p = 0.32)
그림 2에서 볼 수 있듯이, 13,333 리드 기준으로 건강한 위를 가진 여성의 OTU(Operational Taxonomic Units)는 704.6 (범위: 284.1–1145.0)으로, 남성의 470.4 (범위: 159.6–1116.6)보다 높았으며, 이는 통계적으로 유의한 차이를 보였습니다(p = 0.03). 반면, 자가면역성 위염(AAG) 환자에서는 여성의 OTU가 467.2 (174.6–1042.2), 남성은 433.0 (160.6–560.5)으로 나타났으며, 두 성별 간에는 통계적으로 유의한 차이가 없었습니다(p = 0.32).
Figure 2. Box-and-whisker graphs comparing OTUs at 13.333 reads between female and male subjects with healthy stomachs (top) and autoimmune atrophic gastritis (bottom).
3.2. Biodiversity
* Gastric microbiota에 대한 biodiversity (Shannon index - alpha diversity) (Table 3)
- Healthy stomach: Female < Male (3.2 vs. 3.4, p = 0.003)
- AIG patients: Female > Male (3.5 vs. 2.3, p < 0.0001)
- Female: Healthy < AIG (3.2 vs. 3.5, p = 0.002)
- Male: Healthy > AIG (3.4 vs. 2.3, p < 0.001)
표 3에서 볼 수 있듯이, 건강한 위를 가진 대상자들에서는 여성의 위 내 미생물군이 남성보다 유의하게 덜 복잡하고, 생물다양성도 더 낮았습니다(Shannon index 3.2 vs. 3.4, p = 0.003). 반대로 자가면역성 위염(AAG) 환자들에서는 남성이 여성보다 위 내 미생물군의 복잡성이 유의하게 낮고, 생물다양성도 더 낮았습니다(Shannon index 2.3 vs. 3.5, p < 0.0001). 건강한 위를 가진 대상자들과 비교했을 때, AAG 환자들에서는 남성의 위 내 미생물군 생물다양성이 유의하게 더 낮았으며(2.3 vs. 3.4, p < 0.001), 여성의 경우에는 오히려 더 높았습니다(3.5 vs. 3.2, p = 0.002).
Table 3. Comparison of the Shannon index (alpha diversity) between male and female subjects with healthy stomachs and autoimmune atrophic gastritis.
3.3. Taxa Frequency at the Bacterial Phylum and Genus Level
* Histogram plot of the taxa frequency at the bacterial phylum level (Supplementary Figure S1)
- Healthy stomach: Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, and Actinobacteria (most frequent)
- AIG patients: Firmicutes, Proteobacteria, and Bacteroidetes (most frequent)
보조 그림 S1은 건강한 위를 가진 대상자들과 자가면역성 위염(AAG) 환자들에서 성별에 따른 세균 문(phylum) 수준의 분류군 빈도(taxa frequency)를 나타낸 히스토그램을 보여줍니다.
* Taxa frequency at the bacterial phylum level (Table 4)
---> 해석이 잘못되어 있는 것 같습니다. 일단, 본문에 나와 있는데로 정리해서 올립니다.
[Healthy stomachs]
- Firmicutes and Actinobacteria: Females > Males (p = 0.0155, p = 0.0042)
- Fusobacteria: Females ≃ Males (p = 0.4634)
[AIG patients]
- Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes: Females ≃ Males (frequency, not significant)
- Actinobacteria: Females > Males (frequency, not significant)
- Fusobacteria: Females < Males (p = 0.0124)
표 4에서 볼 수 있듯이, 건강한 위?? 를 가진 대상자들의 세균 문(phylum) 수준에서는 Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria가 가장 흔한 세균 문으로 보고되었습니다. 이 중 Firmicutes와 Actinobacteria는 여성에서 남성보다 더 높은 빈도로 나타났으며, 이는 각각 통계적으로 유의한 차이를 보였습니다(p = 0.0155 및 p = 0.0042). 반면, Fusobacteria의 빈도는 건강한 위를 가진 남성과 여성 간에 유사하게 나타났으며, 통계적으로 유의한 차이는 없었습니다(p = 0.4634).
AAG(자가면역성 위염) 환자?? 에서는 Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes가 가장 흔한 위 내 세균 문(phylum)이었으나, 이들의 빈도는 남녀 간에 유사하게 나타났습니다. 또한 Actinobacteria도 AAG 환자들에서 비교적 흔하게 나타났지만, 남성과 여성 간에 유의한 차이는 없었습니다. 반면, Fusobacteria는 여성 AAG 환자에서 남성보다 유의하게 더 높은 빈도를 보였습니다(p = 0.0124).
Table 4. Comparison of taxa frequency at the phylum level between female and male subjects with healthy stomachs and autoimmune atrophic gastritis (AAG).
* Taxa frequency at bacterial genus level (Table 5)
[Healthy stomachs]
- Streptococcus, Prevotella 7, and Granulicatella (most frequency): Females > Males (p = 0.0358, p = 0.0269, and p = 0.0020 respectively)
- Nisseria: no statistically significant gender difference (p = 0.5675)
[AIG patients]
- Streptococcus (most frequency): no statistically significant gender difference (p = 0.7751)
- Prevotella 7 (quietly frequency): no statistically significant gender difference (p = 0.4899)
- Haemophilus, Neisseria and Gemella: Females > Males (p = 0.0223, p = 0.0156, and p = 0.0057 respectively)
세균 속(genus) 수준에서, 건강한 위를 가진 대상자들에서는 Streptococcus, Prevotella 7, Granulicatella가 가장 흔한 위 내 세균 속으로 나타났습니다. 이들 각각은 여성에서 더 많이 나타났고, 남성에서는 상대적으로 적게 나타났으며, 이는 각각 통계적으로 유의한 차이를 보였습니다(p = 0.0358, p = 0.0269, p = 0.0020). 또한, Neisseria도 건강한 위를 가진 대상자들에서 비교적 자주 발견되었으나, 이 경우에는 남성과 여성 간에 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았습니다(p = 0.4899) (원문에 잘못 적은 것 같습니다. p = 0.5675).
반면, AAG(자가면역성 위염) 환자들에서는 Streptococcus가 가장 흔한 위 내 세균 속(genus)으로 나타났으나, 남성과 여성 간에는 통계적으로 유의한 차이가 없었습니다(p = 0.7751). Prevotella 7 역시 비교적 자주 관찰되었지만, 이 경우에도 남녀 간 빈도 차이는 유의하지 않았습니다(p = 0.4899).
반대로, Gemella, Haemophilus, Neisseria는 여성 AAG 환자에서 남성보다 유의하게 더 자주 나타났으며, 각각의 p값은 다음과 같습니다: p = 0.0057, p = 0.0223, p = 0.0156 (자세한 내용은 표 5 참조).
Table 5. Comparison of taxa frequency at the genus level between female and male subjects with healthy stomachs and autoimmune atrophic gastritis (AAG).
3.4. Heatmap and LEfSe Analysis
* Average relative abundance of all genera with a prevalence score > 50% between at least one of the male and female subgroups of samples (Supplementary Figure S2) ---> supple figure2가 첨부되지 않았습니다.
* LEfSE analysis (average relative abundance of all OTUs with >50% prevalence)
- LEfSe bar charts: significant differential abundance of gastric microbiota between the female and male patients
- Streptococcus, Granulicatella, and Gemella: Females >> Males
- Burkholderiaceae family and Lactobacillus: Males >> Females
각 하위 그룹의 위 내 미생물 분류군을 시각적으로 보여주기 위해, 남성 또는 여성 하위 그룹 중 하나에서 유병률 점수(prevalence score)가 50%를 초과한 모든 세균 속(genus)의 평균 상대 풍부도에 기반한 히트맵이 보조 그림 S2에 제시되어 있습니다.
또한, 여성 또는 남성 하위 그룹에서 유병률이 50%를 초과한 모든 OTU(operational taxonomic units)의 평균 상대 풍부도를 기반으로 한 LEfSE 분석도 수행되었습니다. 그림 3은 LDA 점수/효과 크기(effect size)에 따른 LEfSE 막대 차트를 보여주며, 여성과 남성 환자 간 위 내 미생물군의 유의한 차이를 나타냅니다.
특히 여성의 위 내 미생물군은 Streptococcus, Granulicatella, Gemella 등을 포함하여 유의하게 풍부하게 나타났으며, 남성과 비교했을 때 통계적으로 유의한 차이를 보였습니다. 반면, 남성 환자의 위에서는 Burkholderiaceae 계통의 미확인균(U.m.) 및 Lactobacillus 등이 유의하게 더 많이 존재하여, 성별 간 위 내 세균 분포의 차이가 확실하게 나타났음을 확인할 수 있었습니다.
Figure 3. LEfSe analysis based on the average relative abundance of all OTUs with >50% prevalence in female (F) or male (M) subgroups at the genus level according to their LDA score/effect size); mean (solid line) ± SE (dashed line).
4. Discussion
이번 연구는 Healthy stomachs과 AIG 환자 사이에서 gender간의 gastric microbiota에 대한 차이를 보는 첫 연구로써 의미가 있습니다. 이번 연구의 결과를 살펴보면, healthy stomachs의 여성과 남성 사이에 gastric microbiota의 차이를 보면, 여성에서 gastric microbiota의 풍부한 정도는 거의 2배이상 높았지만 다양성에서는 남성에 비해 감소되어 있었습니다.
* Healthy woman: higher bacterial abundance and the less complexity
- Different lifestyles & eating habits
: Higher intake of whole grains, vegetables, fruits, nuts, and fish
: Oral hygiene and tooth health
- Specific role of gender- and sex-related factors (?)
- Different genetic backgrounds, eating habits, social roles (여성과 남성에 있어서 나라별로도 차이를 보임)
* AIG patients: the gender difference in gastric bacterial abundance seems to be reset
- Non-acid intragastric environment에서 Non-acid resistant bacteria가 살아갈 수 있는 환경으로 변하게 됨
- Hypochlorhydria는 여성에 있어서 bacterial abundance를 절반으로 줄였지만, 남성에서는 거의 영향이 없었습니다. 이러한 변화는 단순한 성별의 차이에 따른 변화일 수도 있지만, 성별에 따른 특별한 면역학적, 염증반응 또는 호르몬 등의 영향을 배제할 수 없습니다.
- 과거 연구를 보면, AIG를 가진 여성에서 더 강한 자가면역에 대한 혈청학적 반응을 보였고, HLA-DRB1의 차이를 보였는데, 특히 HLA-DR2, HLA-DR4 에 대한 대립유전가 여성에서 더 빈번하게 관찰되었습니다. 또한, AIG 여성과 남성의 임상적 차이를 보면 여성에서는 주로 정상체중, 소화불량증을 갖는 경우가 흔하고, 철결핍성 빈혈이나 자가면역 갑상선질환을 가지는 경우가 많지만, 남성의 경우는 과체중, 흡연자 및 pernicious anemia를 가지는 경우가 많은 것으로 나타났습니다. (Lahner E, Dilaghi E, Cingolani S et al. Gender-sex differences in autoimmune atrophic gastritis. Transl Res. 2022;248:1–10)
* Biodiversity of the gastric microbiota in AIG patients
- 남성이 여성보다 Less complex & Low diversity 를 보였습니다.
- Biodiversity의 감소는 dysbiosis와 연관성이 있고 이는 neoplastic degeneration의 위험인자 입니다.
(Host cell의 proliferation과 death에 대한 영향, immune system activity의 변화, host metabolism의 변화 등으로 인해)
- 다른 연구에서는, gastric cancer 환자의 경우 healthy controls와 비교하였을 때, 여성에서 less complex, low biodiversitiy를 보였고 남성에서 dysbiosis index는 유사했었습니다. (Gunathilake M, Lee J, Choi IJ, et al. Alterations in Gastric Microbial Communities Are Associated with Risk of Gastric Cancer in a Korean Population: A Case-Control Study. Cancers 2020;12:2619) 이렇게 반대의 결과가 나온 이유에 대해 살펴보면, 본 연구는 AIG환자였고, 타 연구는 gastric cancer 환자에서의 연구였으며 동/서양의 다른 식습관, 라이프 스타일, 및 유전적 배경 등의 차이가 있기 때문으로 보여 집니다.
- AIG는 여성에서 흔하지만 gastric cancer는 AIG의 long term complication으로 알려져 있고, 남성에서 2배 이상 발생률이 높은 것으로 보아 biodiversity가 감소된 남성 AIG 환자의 non-acidic 한 intragastric environment에서 다른 co-player가 있을 수 있음을 암시합니다.
* AIG patients at the genus level
- 이번 연구에서 여성에서 보다 높은 빈도를 보인 genus(종) level은 Gemella, Haemophilus, and Neisseria 였습니다.
- AIG 환자나 hypochlorhydric states 에서 시행한 연구들에서는 gender에 따른 분류는 하지 않았으며, Streptococcus, Gemella and Haemophilus 가 가장 높은 빈도를 보였습니다.
- 여성 AIG 환자에서 이러한 세균 phyla(문)가 더 많이 존재한다는 것이 AIG 발달에 대한 잠재적 원인이 될 수 있는 지는 아직 알수 없습니다.
* Limitation of this study
- small number
- specific lack of data: diet, smoking
- gastroscopy시 physiologic setting: fasting hours, dehydration
- DNA sequencing (live bacteria인지 dead bacteria 인지 알 수 없으며, transient bacteria인지 resident bacteria 인지 구분하지 못함)
<원본 해석>
우리가 아는 한, 본 연구는 건강한 위를 가진 사람들과 자가면역 위축성 위염(AAG) 환자에서 위 마이크로바이오타의 성별 차이를 조사한 최초의 연구입니다. 본 연구 결과에 따르면, 위 마이크로바이오타의 세균 풍부도는 남성과 여성 간에 차이가 있었으며, 건강한 여성의 경우 건강한 남성에 비해 위 내 세균 풍부도가 거의 두 배 정도 높았지만, 미생물 다양성(biodiversity)은 더 낮았습니다. 즉, 건강한 여성에서는 위 마이크로바이오타가 더 풍부하지만 동시에 남성보다 구성의 복잡성은 낮은 것으로 보입니다.
이러한 여성과 남성 간 위 마이크로바이오타의 차이는 성별(gender) 또는 생물학적 성(sex)과 관련된 것으로 해석될 수 있습니다. 위는 식도와 구강을 통해 외부 환경과 연결되어 있으며, 위에서 발견되는 많은 세균은 구강 내에도 존재하며 침이나 음식을 삼킬 때 위로 유입됩니다 [20]. 따라서 위 마이크로바이오타의 구성은 음식, 물, 침, 식습관 등과 같은 환경적 요인의 영향을 받을 수 있습니다. 또한 식이에 따라 장내 마이크로바이오타가 변할 수 있으며, 이러한 변화가 성별에 따라 다를 수 있다는 보고도 있습니다 [16]. 그러나 위 마이크로바이오타에 대한 이와 같은 연구 자료는 현재까지 부족합니다.
이러한 관점에서 볼 때, 여성에서 더 높은 세균 풍부도와 더 낮은 미생물 복잡성 및 다양성이 관찰된 것은 남성과 여성 간의 일반적인 생활습관 및 식습관 차이로 설명될 수 있습니다. 예를 들어, 여성은 전곡류, 채소, 과일, 견과류, 생선 등 항염증 효과가 강한 식품을 더 자주 섭취하는 건강한 식단을 따르는 경향이 있습니다 [21].
또한, 위 마이크로바이오타 구성에 영향을 줄 수 있는 또 다른 요소는 구강 위생 및 치아 건강입니다. 치주 건강 상태의 변화는 세균 군집의 변화와 연관되어 있으며 [22], Sun 등은 P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola의 구강 내 존재가 치주 질환뿐만 아니라 위암의 전암 병변 발생과도 유의미한 연관성이 있다고 보고하였습니다 [23]. 따라서 구강 위생 습관에 대한 성별 차이는 구강 건강 및 치주 질환의 결과에 영향을 주며, 이로 인해 위 마이크로바이오타에도 영향을 미칠 가능성이 있습니다. 이와 같은 다양한 요소들은 위 마이크로바이오타 구성에 영향을 주고, 위 내 균형 잡힌(eubiotic) 환경을 유지하거나 반대로 위 내 이 dysbiosis(불균형)를 유도하는 데 관여할 수 있습니다.
반면, 건강한 남성과 여성 간의 위 마이크로바이오타 차이는 개인의 유전적 특성에서 기인하는 내재적인 요인일 가능성도 배제할 수 없습니다. 여성에서 관찰된 세균 풍부도의 증가와 다양성의 감소에 영향을 미치는 성별 및 생물학적 성 관련 요소들의 구체적인 역할은 앞으로 더 밝혀져야 할 과제입니다.
한편, 한국에서 시행된 위암 환자 및 건강 대조군을 대상으로 한 이전 연구에서는 건강한 여성의 위 마이크로바이오타가 남성보다 더 높은 다양성과 복잡성을 보였다고 보고된 바 있으나, 통계적 유의성(p값)은 명시되지 않았습니다 [24]. 이러한 상반된 결과는 남유럽과 한국 간의 유전적 배경, 식습관, 사회적 성 역할의 차이로 설명될 수 있을 것입니다.
AAG(자가면역 위축성 위염) 환자에서는 위 내 세균 풍부도의 성별 차이가 사라지는 것으로 보이며, 이는 위산 부족(hypochlorhydria)과 그로 인해 형성되는 비산성 위내 환경 때문인 것으로 추정됩니다. 이러한 환경은 위 마이크로바이오타의 구성을 되돌릴 수 없을 정도로 변화시켜, 산에 강하지 않은 세균들도 생존할 수 있게 만듭니다.
본 연구에서는, 건강한 여성의 위 내 세균 풍부도가 남성보다 약 두 배 높았음에도 불구하고, 위산 부족은 여성의 세균 풍부도를 절반으로 감소시킨 반면, 남성에서는 거의 영향을 미치지 않았다는 사실을 확인하였습니다. 이 결과는 성별 특이적(gender-specific) 차이로 해석될 수 있지만, 성호르몬이나 성별에 따른 면역 또는 염증 반응과 같은 생물학적 성(sex)-관련 요인을 배제할 수는 없습니다.
이러한 관점은 AAG에서 나타나는 성별 및 성 차이와도 일치합니다. 기존 연구에서는 AAG가 여성에게 더 흔하며, 여성에서 자가면역 항체 반응이 더 강하게 나타나고 HLA-DRB1 유전자형에서도 차이가 있다고 보고하였습니다. 특히 HLA-DR4와 HLA-DR2 대립유전자가 여성에서 더 자주 발견되었습니다. 또한, AAG는 여성과 남성에서 임상적 특징에도 차이를 보였는데, 여성 환자들은 정상 체중이면서 소화불량, 철 결핍성 빈혈, 자가면역 갑상샘 질환을 동반하는 경우가 많았고, 남성 환자들은 비만 경향이 있으며 흡연자이고 악성 빈혈을 동반하는 경우가 많았습니다 [25].
AAG 환자에서 남성의 위 마이크로바이오타는 여성보다 복잡성과 다양성이 낮아 덜 복잡한 것으로 나타났습니다. 전반적으로, AAG에서 나타나는 만성 염증과 위산 결핍은 남성의 위 마이크로바이오타 다양성을 현저히 감소시키는 반면, 여성에서는 다양성을 증가시키는 정반대의 효과를 유도하는 것으로 보입니다.
위산은 세균 살균 장벽으로서의 방어 기능뿐만 아니라 소화 및 흡수 기능에도 중요한 역할을 합니다. AAG의 특징인 벽세포(parietal cell)의 점진적 파괴는 위산 결핍을 유발하고, 그 결과로 위 내 산성 방어 장벽이 약화되어 위 내 미생물 조성의 변화와 함께 헬리코박터 파일로리 외의 세균들이 과도하게 증식할 수 있습니다 [13,14].
본 연구에서는 AAG 환자에서 남성의 위 마이크로바이오타 다양성이 여성보다 유의하게 낮게 나타났습니다. 세균 다양성의 감소는 위내 세균 불균형(dysbiosis)과 밀접한 관련이 있으며, 이는 세포 증식과 세포사멸 조절, 면역 시스템의 활동 변화, 숙주 대사 조절을 통해 종양성 변화(neoplastic degeneration)를 촉진하는 요인으로 제시되고 있습니다 [26]. Gunathilake 등은 위암 여성 환자의 위 마이크로바이오타가 건강한 대조군 여성에 비해 더 단순하고 다양성이 낮았다고 보고한 바 있습니다. 그러나 남성에서는 위암 환자와 대조군 간의 dysbiosis 지수 차이가 없었습니다 [24]. 이러한 상반된 결과는 연구 대상의 차이로 설명될 수 있습니다. 기존 연구는 위암 환자를 포함한 반면, 본 연구는 전암성 상태인 AAG 환자를 대상으로 하였으며, 식습관, 생활 방식, 유전적 배경 등의 차이도 결과에 영향을 미쳤을 수 있습니다.
AAG는 역학적으로 여성에서 더 흔하지만 [10,27], AAG의 장기적 합병증인 위암은 남성에서 더 많이 발생합니다. 위암은 전 세계적으로 다섯 번째로 흔한 암이며, 남성은 여성보다 거의 두 배 높은 발생률을 보입니다(남성: 15.8, 여성: 7.0/10만 명당) [28]. 위산이 없는 위 환경이 남성 AAG 환자에서 더 큰 영향을 미쳐 다양성을 감소시키는 현상은, 위암이 남성에서 더 흔한 이유 중 하나로 작용할 가능성도 있습니다.
또한 본 연구에서는 AAG 환자의 위 마이크로바이오타를 속(genus) 수준에서 분석한 결과, Gemella, Haemophilus, Neisseria가 여성에서 남성보다 유의하게 더 자주 발견되었습니다. 위산 결핍 상태에서의 인간 위 마이크로바이오타에 관한 기존 연구에서도 Streptococcus 다음으로 Gemella와 Haemophilus가 AAG 환자에서 가장 우세한 속으로 보고되었으며 [15], 이는 또 다른 연구에서도 확인되었습니다 [13]. 다만 기존 연구들에서는 성별에 따른 분석이 이루어지지 않았습니다. AAG는 다른 자가면역 질환과 마찬가지로 여성에서 더 흔한데, 여성 AAG 환자에서 이들 세균이 더 많이 존재하는 것은 이들이 AAG 발병에 병인적 역할을 할 가능성을 시사합니다.
본 연구의 주요 제한점으로는, 비교적 소규모의 표본 수와 연구 대상자의 식이 및 흡연 습관에 대한 자료 부족이 있습니다. 또한 위내시경은 몇 시간의 금식과 탈수를 포함하는 비정상적인 상태에서 시행되므로, 위 마이크로바이오타의 실제 동적 상태를 반영하지 못할 수 있습니다. 마지막으로, 본 연구에서 사용한 DNA 시퀀싱 방법은 살아있는 세균과 죽은 세균, 정착균과 일시균을 구분하지 못하는 한계가 있습니다.
5. Conclusions
In conclusion, the current study shows that the gender differences in gastric microbiota, particularly a higher gastric bacterial abundance and less microbial diversity in healthy women compared to men, seem to be reset in autoimmune atrophic gastritis, likely due to hypochlorhydria and the non-acid intragastric environment, reducing biodiversity to greater extent in men. The impact of these findings on gastric physiology and the gender specific natural history of autoimmune atrophic gastritis remains to be elucidated; in any case, gender differences deserve attention in gastric microbiota studies.
다음 연구에서는 이러한 성별의 차이를 고려하여, 질환에 대한 잠재적 차이에 대한 microbiota의 효과적인 역할 및 질환에 대해 성별이 미치는 영향을 고려하여 진행될 수 있을 것 같습니다.
Abstract: Gender differences and microbiota are gaining increasing attention. This study aimed to assess gender differences in gastric bacterial microbiota between subjects with healthy stomachs and those with autoimmune atrophic gastritis. This was a post hoc analysis of 52 subjects undergoing gastroscopy for dyspepsia (57.7% healthy stomach, 42.3% autoimmune atrophic gastritis). Gastric biopsies were obtained for histopathology and genomic DNA extraction. Gastric microbiota were assessed by sequencing the hypervariable regions of the 16SrRNA gene. The bacterial profile at the phylum level was reported as being in relative abundance expressed as 16SrRNA OTUs (>0.5%) and biodiversity calculated as Shannon-diversity index-H. All data were stratified for the female and male gender. Results showed that women with healthy stomachs had a higher gastric bacterial abundance and less microbial diversity compared to men. Likely due to hypochlorhydria and the non-acid intragastric environment, autoimmune atrophic gastritis seems to reset gender differences in gastric bacterial abundance and reduce biodiversity in males, showing a greater extent of dysbiosis in terms of reduced biodiversity in men. Differences between gender on taxa frequency at the phylum and genus level in healthy subjects and autoimmune atrophic gastritis were observed. The impact of these findings on the gender-specific natural history of autoimmune atrophic gastritis remains to be elucidated; in any case, gender differences should deserve attention in gastric microbiota studies.
Microorganisms. 2023 Jul 29;11(8):1938. doi: 10.3390/microorganisms11081938
최근 gender 및 microbiota 에 대한 관심이 높습니다. AIG 환자에서 Gender와 microbiota 관련 논문이 최근 발표되어 정리해 보겠습니다.
* 알파다양성: 미생물 무리 자체의 다양성 (얼마나 많은 수의 미생물이 있는지 (richness)와 얼마나 고르게 분포되어 있는지 (evenness))
* 베타다양성: 미생물 무리 구성이 대조군의 미생물 무리 구성과 어떻게 다른가에 대한 내용 (상대적인 값)
1. Introduction
최근 임상적 분야, 특히 자가면역질환에서 gender 간의 차이에 대해 지속적인 관심이 증가되고 있습니다. AIG(AAG로 표현함)를 포함한 자가면역질환의 prevalence, severity 그리고 natural history에 대해 gender는 중요한 역할을 갖습니다. 몇몇 질환에서는 gender specific sex hormones, 면역 반응에 대한 gender-sex differences, gender-related organ의 취약성 사이에서 gender differences를 보이고 있습니다. 또한, 인간의 microbiota는 매우 흥미로운 주제로 과학계 에서는 많은 관심을 받고 있습니다. 앞선 연구에서 AIG는 oxyntic mucosa atrophy와 impaired gastric acid secretion으로 인한 hypochlorhydria는 intragastric bacteria의 과 증식이 이루어 질 수 있어서 gastric microbiota의 구성에 영향을 미칠 수 있습니다. 어떤 연구에서는 gender에 의한 질환에 잠재적인 영향을 미치는 것으로 장내 microbiota가 역할을 할 것이라고도 하였습니다. 이번 연구는, 건강한 stoamch과 AIG 환자에서 gastric microbiota의 구성이 gender에 따라 차이가 있는지를 조사하는 것입니다.
<원본 번역>
자가면역 위축성 위염(Autoimmune atrophic gastritis, AAG)은 만성 염증성 질환으로, 위의 산 분비 세포인 옥신틱 점막(oxyntic mucosa)의 위축, 위산 및 내인자의 분비 감소를 유발하며, 벽세포(parietal cell) 및/또는 내인자에 대한 자가항체가 자주 양성으로 나타나는 것이 특징입니다 [1]. 또한 AAG에서는 펩시노겐 I 수치가 낮고 고가스트린혈증(hypergastrinemia)이 흔히 동반되며, 이들은 위 점막 손상 및 위축의 생체표지자로 간주됩니다 [2]. AAG의 정확한 발병 기전은 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 옥신틱 점막의 자가면역적 파괴를 유발하는 주요 작용세포는 자가반응성 T세포로 알려져 있으나, 이들의 유발 인자는 명확하지 않으며, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)가 항원 교차반응(antigen cross-reactivity)을 통해 일정한 역할을 할 가능성이 제기되어 왔습니다 [3].
AAG의 가장 초기 생화학적 증상은 거대적아구성 빈혈(pernicious anemia) 또는 소적혈구성 빈혈(microcytic anemia)로, 각각 코발라민(비타민 B12) 또는 철 결핍으로 인해 발생합니다. 환자의 약 절반에서는 소화불량, 명치통증(epigastric pain), 식후 포만감, 그리고 역류 질환 등의 증상이 나타날 수 있습니다 [4]. AAG는 위 이형성(dysplasia) 및 선암(adenocarcinoma), 그리고 제1형 신경내분비종양(type I neuroendocrine tumors)으로 진행할 수 있는 전암성 질환(pre-neoplastic condition)으로 간주되어야 합니다 [1,5][6–8]. 또한 AAG는 다른 자가면역 질환, 특히 자가면역 갑상샘 질환(예: 하시모토 갑상샘염)이나 제1형 당뇨병과 자주 동반됩니다 [9,10].
최근 몇 년 사이, 성별 및 생물학적 성(sex) 차이에 관한 관심이 다양한 임상 분야, 특히 자가면역 질환에서 증가하고 있습니다. 성별은 AAG와 같은 자가면역 질환의 유병률, 중증도 및 자연 경과 전반에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 성별 차이에 대한 가능한 설명으로는 성별 특이적인 성호르몬, 면역 반응에서의 성 차이, 그리고 성별에 따른 장기 취약성 등이 있습니다 [11,12].
또한, 인간 마이크로바이오타(microbiota)에 대한 과학계의 관심이 크게 증가하고 있습니다. 이전 연구들에서는 AAG가 위 마이크로바이오타 구성의 변화와 관련이 있을 수 있다고 보고하였습니다. 실제로 AAG에서 옥시닉 점막의 위축과 위산 분비 저하로 인해 위 내 세균 증식이 촉진될 수 있는 환경이 조성됩니다 [13–15]. 일부 연구에서는 장내 마이크로바이오타가 질병에 대한 성별 감수성에 영향을 줄 수 있는 가능성도 제기하였습니다 [16]. 그러나 현재까지 위 마이크로바이오타의 성별 차이에 대한 자료는 부족한 실정입니다.
따라서 본 연구에서는 건강한 위를 가진 사람들과 AAG 환자들을 대상으로 위 마이크로바이오타 구성에서의 성별 차이를 조사하고자 하였습니다.
2. Materials and Methods
- H. pylori 양성 환자는 연구에서 배제 하였습니다.
- 52 adult subjects (median age 61 years, range 18–83, 32 females and 20 males)
- 항생제, 위산분비억제제 등은 최소 3주 이상 끊었으며, 모든 환자에서 식단의 제한을 두지는 않았습니다.
- Gastric biopsy: update Sydney system
- 30 subjects (57.7%): healthy stomachs vs. 22 (42.3%) patients: H. pylori-negative AAG (Table 1)
Table 1. Main clinical characteristics of the included subjects with healthy stomachs and autoimmune atrophic gastritis (AAG).
2.1. Gastric Biopsy Sampling
- Genomic DNA extraction과 16SrRNA gene sequencing을 위해서 antrum과 body에서 각각 1개 씩 additional biopsies와 조직학적 평가를 시행하였습니다.
- Gastric microbiota assessment 를 위한 sample은 GC side의 조직검사를 수행한 바로 인접한 부위에서 얻었습니다.
2.2. Bacterial Microbiota Identification by 16SrRNA Gene Sequencing and Data Analysis
- Genomic DNA extraction: PureLink™ Microbiome DNA Purification Kit
- DNA library: Ion16S™ Metagenomics Kit (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) (primer sets V2-4-8 and V3-6,7-9)
- Template preparation and chip loading: IonS5 Ion Chef™ System / Sequencing: IonS5 System
- Fastq files: using a custom script based on the QIIME2 software
- Quality control: sequences with a length between 140 and 400 bp and a mean sequence quality score > 20
(sequences with homopolymers >7 bp and mismatched primers는 생략)
- 16SrRNA Operational Taxonomic Units (OTUs): diversity measures (alpha and beta diversity)
- Bacterial profiles: phylum & genus levels (only taxa with relative abundance > 0.5%)
- Biodiversity (alpha diversity): Box-and-whisker plots (calculated as Shannon-diversity index-H)
2.3. Statistical Analyses
- To compare the abundance and diversity of bacterial genera between groups: Mann–Whitney test
- To compare biodiversity (Shannon index): Student’s t-test
- Beta-diversity in female and male subjects with healthy stomachs and patients with AAG: Permanova
- Principal Coordinates Analysis (PCoA) 3D representation of beta-diversity of bacterial genera abundance (Bray-Curtis matrix): Origin Pro 2023
- Average relative abundance of all OTUs with >50% prevalence in female or male subgroups: Lda Effective Size (LEfSe) analysis
- Heatmap based on the average relative abundance of all genera that showed a prevalence score > 50% between at least one of the male and female subgroups of samples.
3. Results
3.1. Gastric Bacterial Abundance
* Gastric abundance & composition of bacterial genera (Figure 1)
- Healthy stomachs and AIG patients: p = 0.005, R2 0.03733
- Females and males of healthy subjects and AIG patients: p = 0.014, R2 0.02797
건강한 위를 가진 사람들과 자가면역성 위염(AAG) 환자들 간의 위 내 세균 속(bacterial genera)의 풍부도(abundance)와 조성(composition)은 유의하게 다른 것으로 확인되었습니다(p = 0.005, R² = 0.03733). 또한, 건강한 대상자들과 자가면역성 위염 환자들 사이에서 남성과 여성 간의 위 내 세균 풍부도와 조성 역시 유의한 차이를 보였습니다(p = 0.014, R² = 0.02797). 이는 건강한 위를 가진 남녀와 AAG 환자인 남녀의 군집이 각각 분리되어 나타나는 PCoA 3차원(3D) 시각화에서도 확인할 수 있습니다(Figure 1 참조).
Figure 1. 3D Principal Coordinate Analysis of beta-diversity of bacterial genera abundance based on Bray–Curtis matrix of subjects with healthy stomachs and patients with autoimmune atrophic gastritis subdivided by gender (red spheres = females, blue spheres = males, p < 0.05). x,y,z-axis PC1, PC2, PC3.
* Gastric bacterial abundance (Table 2)
- Healthy stomachs: Females >> Males (23,333 reads만 빼고)
- AIG patients: Females ≃ Males
표 2에서 볼 수 있듯이, 건강한 위를 가진 대상자들 중 여성은 남성보다 위 내 세균 풍부도가 더 높았으며, 23,333 리드를 제외한 모든 리드 수에서 통계적으로 유의한 차이를 보였습니다. 반면, 자가면역성 위염(AAG) 환자들의 경우, 모든 리드 수에서 남녀 간 위 내 세균 풍부도가 유사하게 나타났습니다.
Table 2. Comparison of OTUs at different reads between male and female subjects with healthy stomachs and autoimmune atrophic gastritis.
* OTUs (13,333 reads, Figure 2)
- Healthy stomachs: Female 704.6 (284.1–1145.0) vs. Male 470.4 (159.6–1116.6) (p = 0.03, 통계적 차이가 가장 큼)
- AIG patientes: Female 467.2 (174.6–1042.2) vs. Male 433.0 (160.6–560.5) (p = 0.32)
그림 2에서 볼 수 있듯이, 13,333 리드 기준으로 건강한 위를 가진 여성의 OTU(Operational Taxonomic Units)는 704.6 (범위: 284.1–1145.0)으로, 남성의 470.4 (범위: 159.6–1116.6)보다 높았으며, 이는 통계적으로 유의한 차이를 보였습니다(p = 0.03). 반면, 자가면역성 위염(AAG) 환자에서는 여성의 OTU가 467.2 (174.6–1042.2), 남성은 433.0 (160.6–560.5)으로 나타났으며, 두 성별 간에는 통계적으로 유의한 차이가 없었습니다(p = 0.32).
Figure 2. Box-and-whisker graphs comparing OTUs at 13.333 reads between female and male subjects with healthy stomachs (top) and autoimmune atrophic gastritis (bottom).
3.2. Biodiversity
* Gastric microbiota에 대한 biodiversity (Shannon index - alpha diversity) (Table 3)
- Healthy stomach: Female < Male (3.2 vs. 3.4, p = 0.003)
- AIG patients: Female > Male (3.5 vs. 2.3, p < 0.0001)
- Female: Healthy < AIG (3.2 vs. 3.5, p = 0.002)
- Male: Healthy > AIG (3.4 vs. 2.3, p < 0.001)
표 3에서 볼 수 있듯이, 건강한 위를 가진 대상자들에서는 여성의 위 내 미생물군이 남성보다 유의하게 덜 복잡하고, 생물다양성도 더 낮았습니다(Shannon index 3.2 vs. 3.4, p = 0.003). 반대로 자가면역성 위염(AAG) 환자들에서는 남성이 여성보다 위 내 미생물군의 복잡성이 유의하게 낮고, 생물다양성도 더 낮았습니다(Shannon index 2.3 vs. 3.5, p < 0.0001). 건강한 위를 가진 대상자들과 비교했을 때, AAG 환자들에서는 남성의 위 내 미생물군 생물다양성이 유의하게 더 낮았으며(2.3 vs. 3.4, p < 0.001), 여성의 경우에는 오히려 더 높았습니다(3.5 vs. 3.2, p = 0.002).
Table 3. Comparison of the Shannon index (alpha diversity) between male and female subjects with healthy stomachs and autoimmune atrophic gastritis.
3.3. Taxa Frequency at the Bacterial Phylum and Genus Level
* Histogram plot of the taxa frequency at the bacterial phylum level (Supplementary Figure S1)
- Healthy stomach: Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, and Actinobacteria (most frequent)
- AIG patients: Firmicutes, Proteobacteria, and Bacteroidetes (most frequent)
보조 그림 S1은 건강한 위를 가진 대상자들과 자가면역성 위염(AAG) 환자들에서 성별에 따른 세균 문(phylum) 수준의 분류군 빈도(taxa frequency)를 나타낸 히스토그램을 보여줍니다.
* Taxa frequency at the bacterial phylum level (Table 4)
---> 해석이 잘못되어 있는 것 같습니다. 일단, 본문에 나와 있는데로 정리해서 올립니다.
[Healthy stomachs]
- Firmicutes and Actinobacteria: Females > Males (p = 0.0155, p = 0.0042)
- Fusobacteria: Females ≃ Males (p = 0.4634)
[AIG patients]
- Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes: Females ≃ Males (frequency, not significant)
- Actinobacteria: Females > Males (frequency, not significant)
- Fusobacteria: Females < Males (p = 0.0124)
표 4에서 볼 수 있듯이, 건강한 위?? 를 가진 대상자들의 세균 문(phylum) 수준에서는 Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria가 가장 흔한 세균 문으로 보고되었습니다. 이 중 Firmicutes와 Actinobacteria는 여성에서 남성보다 더 높은 빈도로 나타났으며, 이는 각각 통계적으로 유의한 차이를 보였습니다(p = 0.0155 및 p = 0.0042). 반면, Fusobacteria의 빈도는 건강한 위를 가진 남성과 여성 간에 유사하게 나타났으며, 통계적으로 유의한 차이는 없었습니다(p = 0.4634).
AAG(자가면역성 위염) 환자?? 에서는 Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes가 가장 흔한 위 내 세균 문(phylum)이었으나, 이들의 빈도는 남녀 간에 유사하게 나타났습니다. 또한 Actinobacteria도 AAG 환자들에서 비교적 흔하게 나타났지만, 남성과 여성 간에 유의한 차이는 없었습니다. 반면, Fusobacteria는 여성 AAG 환자에서 남성보다 유의하게 더 높은 빈도를 보였습니다(p = 0.0124).
Table 4. Comparison of taxa frequency at the phylum level between female and male subjects with healthy stomachs and autoimmune atrophic gastritis (AAG).
* Taxa frequency at bacterial genus level (Table 5)
[Healthy stomachs]
- Streptococcus, Prevotella 7, and Granulicatella (most frequency): Females > Males (p = 0.0358, p = 0.0269, and p = 0.0020 respectively)
- Nisseria: no statistically significant gender difference (p = 0.5675)
[AIG patients]
- Streptococcus (most frequency): no statistically significant gender difference (p = 0.7751)
- Prevotella 7 (quietly frequency): no statistically significant gender difference (p = 0.4899)
- Haemophilus, Neisseria and Gemella: Females > Males (p = 0.0223, p = 0.0156, and p = 0.0057 respectively)
세균 속(genus) 수준에서, 건강한 위를 가진 대상자들에서는 Streptococcus, Prevotella 7, Granulicatella가 가장 흔한 위 내 세균 속으로 나타났습니다. 이들 각각은 여성에서 더 많이 나타났고, 남성에서는 상대적으로 적게 나타났으며, 이는 각각 통계적으로 유의한 차이를 보였습니다(p = 0.0358, p = 0.0269, p = 0.0020). 또한, Neisseria도 건강한 위를 가진 대상자들에서 비교적 자주 발견되었으나, 이 경우에는 남성과 여성 간에 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았습니다(
p = 0.4899) (원문에 잘못 적은 것 같습니다. p = 0.5675).반면, AAG(자가면역성 위염) 환자들에서는 Streptococcus가 가장 흔한 위 내 세균 속(genus)으로 나타났으나, 남성과 여성 간에는 통계적으로 유의한 차이가 없었습니다(p = 0.7751). Prevotella 7 역시 비교적 자주 관찰되었지만, 이 경우에도 남녀 간 빈도 차이는 유의하지 않았습니다(p = 0.4899).
반대로, Gemella, Haemophilus, Neisseria는 여성 AAG 환자에서 남성보다 유의하게 더 자주 나타났으며, 각각의 p값은 다음과 같습니다: p = 0.0057, p = 0.0223, p = 0.0156 (자세한 내용은 표 5 참조).
Table 5. Comparison of taxa frequency at the genus level between female and male subjects with healthy stomachs and autoimmune atrophic gastritis (AAG).
3.4. Heatmap and LEfSe Analysis
* Average relative abundance of all genera with a prevalence score > 50% between at least one of the male and female subgroups of samples (Supplementary Figure S2) ---> supple figure2가 첨부되지 않았습니다.
* LEfSE analysis (average relative abundance of all OTUs with >50% prevalence)
- LEfSe bar charts: significant differential abundance of gastric microbiota between the female and male patients
- Streptococcus, Granulicatella, and Gemella: Females >> Males
- Burkholderiaceae family and Lactobacillus: Males >> Females
각 하위 그룹의 위 내 미생물 분류군을 시각적으로 보여주기 위해, 남성 또는 여성 하위 그룹 중 하나에서 유병률 점수(prevalence score)가 50%를 초과한 모든 세균 속(genus)의 평균 상대 풍부도에 기반한 히트맵이 보조 그림 S2에 제시되어 있습니다.
또한, 여성 또는 남성 하위 그룹에서 유병률이 50%를 초과한 모든 OTU(operational taxonomic units)의 평균 상대 풍부도를 기반으로 한 LEfSE 분석도 수행되었습니다. 그림 3은 LDA 점수/효과 크기(effect size)에 따른 LEfSE 막대 차트를 보여주며, 여성과 남성 환자 간 위 내 미생물군의 유의한 차이를 나타냅니다.
특히 여성의 위 내 미생물군은 Streptococcus, Granulicatella, Gemella 등을 포함하여 유의하게 풍부하게 나타났으며, 남성과 비교했을 때 통계적으로 유의한 차이를 보였습니다. 반면, 남성 환자의 위에서는 Burkholderiaceae 계통의 미확인균(U.m.) 및 Lactobacillus 등이 유의하게 더 많이 존재하여, 성별 간 위 내 세균 분포의 차이가 확실하게 나타났음을 확인할 수 있었습니다.
Figure 3. LEfSe analysis based on the average relative abundance of all OTUs with >50% prevalence in female (F) or male (M) subgroups at the genus level according to their LDA score/effect size); mean (solid line) ± SE (dashed line).
4. Discussion
이번 연구는 Healthy stomachs과 AIG 환자 사이에서 gender간의 gastric microbiota에 대한 차이를 보는 첫 연구로써 의미가 있습니다. 이번 연구의 결과를 살펴보면, healthy stomachs의 여성과 남성 사이에 gastric microbiota의 차이를 보면, 여성에서 gastric microbiota의 풍부한 정도는 거의 2배이상 높았지만 다양성에서는 남성에 비해 감소되어 있었습니다.
* Healthy woman: higher bacterial abundance and the less complexity
- Different lifestyles & eating habits
: Higher intake of whole grains, vegetables, fruits, nuts, and fish
: Oral hygiene and tooth health
- Specific role of gender- and sex-related factors (?)
- Different genetic backgrounds, eating habits, social roles (여성과 남성에 있어서 나라별로도 차이를 보임)
* AIG patients: the gender difference in gastric bacterial abundance seems to be reset
- Non-acid intragastric environment에서 Non-acid resistant bacteria가 살아갈 수 있는 환경으로 변하게 됨
- Hypochlorhydria는 여성에 있어서 bacterial abundance를 절반으로 줄였지만, 남성에서는 거의 영향이 없었습니다. 이러한 변화는 단순한 성별의 차이에 따른 변화일 수도 있지만, 성별에 따른 특별한 면역학적, 염증반응 또는 호르몬 등의 영향을 배제할 수 없습니다.
- 과거 연구를 보면, AIG를 가진 여성에서 더 강한 자가면역에 대한 혈청학적 반응을 보였고, HLA-DRB1의 차이를 보였는데, 특히 HLA-DR2, HLA-DR4 에 대한 대립유전가 여성에서 더 빈번하게 관찰되었습니다. 또한, AIG 여성과 남성의 임상적 차이를 보면 여성에서는 주로 정상체중, 소화불량증을 갖는 경우가 흔하고, 철결핍성 빈혈이나 자가면역 갑상선질환을 가지는 경우가 많지만, 남성의 경우는 과체중, 흡연자 및 pernicious anemia를 가지는 경우가 많은 것으로 나타났습니다. (Lahner E, Dilaghi E, Cingolani S et al. Gender-sex differences in autoimmune atrophic gastritis. Transl Res. 2022;248:1–10)
* Biodiversity of the gastric microbiota in AIG patients
- 남성이 여성보다 Less complex & Low diversity 를 보였습니다.
- Biodiversity의 감소는 dysbiosis와 연관성이 있고 이는 neoplastic degeneration의 위험인자 입니다.
(Host cell의 proliferation과 death에 대한 영향, immune system activity의 변화, host metabolism의 변화 등으로 인해)
- 다른 연구에서는, gastric cancer 환자의 경우 healthy controls와 비교하였을 때, 여성에서 less complex, low biodiversitiy를 보였고 남성에서 dysbiosis index는 유사했었습니다. (Gunathilake M, Lee J, Choi IJ, et al. Alterations in Gastric Microbial Communities Are Associated with Risk of Gastric Cancer in a Korean Population: A Case-Control Study. Cancers 2020;12:2619) 이렇게 반대의 결과가 나온 이유에 대해 살펴보면, 본 연구는 AIG환자였고, 타 연구는 gastric cancer 환자에서의 연구였으며 동/서양의 다른 식습관, 라이프 스타일, 및 유전적 배경 등의 차이가 있기 때문으로 보여 집니다.
- AIG는 여성에서 흔하지만 gastric cancer는 AIG의 long term complication으로 알려져 있고, 남성에서 2배 이상 발생률이 높은 것으로 보아 biodiversity가 감소된 남성 AIG 환자의 non-acidic 한 intragastric environment에서 다른 co-player가 있을 수 있음을 암시합니다.
* AIG patients at the genus level
- 이번 연구에서 여성에서 보다 높은 빈도를 보인 genus(종) level은 Gemella, Haemophilus, and Neisseria 였습니다.
- AIG 환자나 hypochlorhydric states 에서 시행한 연구들에서는 gender에 따른 분류는 하지 않았으며, Streptococcus, Gemella and Haemophilus 가 가장 높은 빈도를 보였습니다.
- 여성 AIG 환자에서 이러한 세균 phyla(문)가 더 많이 존재한다는 것이 AIG 발달에 대한 잠재적 원인이 될 수 있는 지는 아직 알수 없습니다.
* Limitation of this study
- small number
- specific lack of data: diet, smoking
- gastroscopy시 physiologic setting: fasting hours, dehydration
- DNA sequencing (live bacteria인지 dead bacteria 인지 알 수 없으며, transient bacteria인지 resident bacteria 인지 구분하지 못함)
<원본 해석>
우리가 아는 한, 본 연구는 건강한 위를 가진 사람들과 자가면역 위축성 위염(AAG) 환자에서 위 마이크로바이오타의 성별 차이를 조사한 최초의 연구입니다. 본 연구 결과에 따르면, 위 마이크로바이오타의 세균 풍부도는 남성과 여성 간에 차이가 있었으며, 건강한 여성의 경우 건강한 남성에 비해 위 내 세균 풍부도가 거의 두 배 정도 높았지만, 미생물 다양성(biodiversity)은 더 낮았습니다. 즉, 건강한 여성에서는 위 마이크로바이오타가 더 풍부하지만 동시에 남성보다 구성의 복잡성은 낮은 것으로 보입니다.
이러한 여성과 남성 간 위 마이크로바이오타의 차이는 성별(gender) 또는 생물학적 성(sex)과 관련된 것으로 해석될 수 있습니다. 위는 식도와 구강을 통해 외부 환경과 연결되어 있으며, 위에서 발견되는 많은 세균은 구강 내에도 존재하며 침이나 음식을 삼킬 때 위로 유입됩니다 [20]. 따라서 위 마이크로바이오타의 구성은 음식, 물, 침, 식습관 등과 같은 환경적 요인의 영향을 받을 수 있습니다. 또한 식이에 따라 장내 마이크로바이오타가 변할 수 있으며, 이러한 변화가 성별에 따라 다를 수 있다는 보고도 있습니다 [16]. 그러나 위 마이크로바이오타에 대한 이와 같은 연구 자료는 현재까지 부족합니다.
이러한 관점에서 볼 때, 여성에서 더 높은 세균 풍부도와 더 낮은 미생물 복잡성 및 다양성이 관찰된 것은 남성과 여성 간의 일반적인 생활습관 및 식습관 차이로 설명될 수 있습니다. 예를 들어, 여성은 전곡류, 채소, 과일, 견과류, 생선 등 항염증 효과가 강한 식품을 더 자주 섭취하는 건강한 식단을 따르는 경향이 있습니다 [21].
또한, 위 마이크로바이오타 구성에 영향을 줄 수 있는 또 다른 요소는 구강 위생 및 치아 건강입니다. 치주 건강 상태의 변화는 세균 군집의 변화와 연관되어 있으며 [22], Sun 등은 P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola의 구강 내 존재가 치주 질환뿐만 아니라 위암의 전암 병변 발생과도 유의미한 연관성이 있다고 보고하였습니다 [23]. 따라서 구강 위생 습관에 대한 성별 차이는 구강 건강 및 치주 질환의 결과에 영향을 주며, 이로 인해 위 마이크로바이오타에도 영향을 미칠 가능성이 있습니다. 이와 같은 다양한 요소들은 위 마이크로바이오타 구성에 영향을 주고, 위 내 균형 잡힌(eubiotic) 환경을 유지하거나 반대로 위 내 이 dysbiosis(불균형)를 유도하는 데 관여할 수 있습니다.
반면, 건강한 남성과 여성 간의 위 마이크로바이오타 차이는 개인의 유전적 특성에서 기인하는 내재적인 요인일 가능성도 배제할 수 없습니다. 여성에서 관찰된 세균 풍부도의 증가와 다양성의 감소에 영향을 미치는 성별 및 생물학적 성 관련 요소들의 구체적인 역할은 앞으로 더 밝혀져야 할 과제입니다.
한편, 한국에서 시행된 위암 환자 및 건강 대조군을 대상으로 한 이전 연구에서는 건강한 여성의 위 마이크로바이오타가 남성보다 더 높은 다양성과 복잡성을 보였다고 보고된 바 있으나, 통계적 유의성(p값)은 명시되지 않았습니다 [24]. 이러한 상반된 결과는 남유럽과 한국 간의 유전적 배경, 식습관, 사회적 성 역할의 차이로 설명될 수 있을 것입니다.
AAG(자가면역 위축성 위염) 환자에서는 위 내 세균 풍부도의 성별 차이가 사라지는 것으로 보이며, 이는 위산 부족(hypochlorhydria)과 그로 인해 형성되는 비산성 위내 환경 때문인 것으로 추정됩니다. 이러한 환경은 위 마이크로바이오타의 구성을 되돌릴 수 없을 정도로 변화시켜, 산에 강하지 않은 세균들도 생존할 수 있게 만듭니다.
본 연구에서는, 건강한 여성의 위 내 세균 풍부도가 남성보다 약 두 배 높았음에도 불구하고, 위산 부족은 여성의 세균 풍부도를 절반으로 감소시킨 반면, 남성에서는 거의 영향을 미치지 않았다는 사실을 확인하였습니다. 이 결과는 성별 특이적(gender-specific) 차이로 해석될 수 있지만, 성호르몬이나 성별에 따른 면역 또는 염증 반응과 같은 생물학적 성(sex)-관련 요인을 배제할 수는 없습니다.
이러한 관점은 AAG에서 나타나는 성별 및 성 차이와도 일치합니다. 기존 연구에서는 AAG가 여성에게 더 흔하며, 여성에서 자가면역 항체 반응이 더 강하게 나타나고 HLA-DRB1 유전자형에서도 차이가 있다고 보고하였습니다. 특히 HLA-DR4와 HLA-DR2 대립유전자가 여성에서 더 자주 발견되었습니다. 또한, AAG는 여성과 남성에서 임상적 특징에도 차이를 보였는데, 여성 환자들은 정상 체중이면서 소화불량, 철 결핍성 빈혈, 자가면역 갑상샘 질환을 동반하는 경우가 많았고, 남성 환자들은 비만 경향이 있으며 흡연자이고 악성 빈혈을 동반하는 경우가 많았습니다 [25].
AAG 환자에서 남성의 위 마이크로바이오타는 여성보다 복잡성과 다양성이 낮아 덜 복잡한 것으로 나타났습니다. 전반적으로, AAG에서 나타나는 만성 염증과 위산 결핍은 남성의 위 마이크로바이오타 다양성을 현저히 감소시키는 반면, 여성에서는 다양성을 증가시키는 정반대의 효과를 유도하는 것으로 보입니다.
위산은 세균 살균 장벽으로서의 방어 기능뿐만 아니라 소화 및 흡수 기능에도 중요한 역할을 합니다. AAG의 특징인 벽세포(parietal cell)의 점진적 파괴는 위산 결핍을 유발하고, 그 결과로 위 내 산성 방어 장벽이 약화되어 위 내 미생물 조성의 변화와 함께 헬리코박터 파일로리 외의 세균들이 과도하게 증식할 수 있습니다 [13,14].
본 연구에서는 AAG 환자에서 남성의 위 마이크로바이오타 다양성이 여성보다 유의하게 낮게 나타났습니다. 세균 다양성의 감소는 위내 세균 불균형(dysbiosis)과 밀접한 관련이 있으며, 이는 세포 증식과 세포사멸 조절, 면역 시스템의 활동 변화, 숙주 대사 조절을 통해 종양성 변화(neoplastic degeneration)를 촉진하는 요인으로 제시되고 있습니다 [26]. Gunathilake 등은 위암 여성 환자의 위 마이크로바이오타가 건강한 대조군 여성에 비해 더 단순하고 다양성이 낮았다고 보고한 바 있습니다. 그러나 남성에서는 위암 환자와 대조군 간의 dysbiosis 지수 차이가 없었습니다 [24]. 이러한 상반된 결과는 연구 대상의 차이로 설명될 수 있습니다. 기존 연구는 위암 환자를 포함한 반면, 본 연구는 전암성 상태인 AAG 환자를 대상으로 하였으며, 식습관, 생활 방식, 유전적 배경 등의 차이도 결과에 영향을 미쳤을 수 있습니다.
AAG는 역학적으로 여성에서 더 흔하지만 [10,27], AAG의 장기적 합병증인 위암은 남성에서 더 많이 발생합니다. 위암은 전 세계적으로 다섯 번째로 흔한 암이며, 남성은 여성보다 거의 두 배 높은 발생률을 보입니다(남성: 15.8, 여성: 7.0/10만 명당) [28]. 위산이 없는 위 환경이 남성 AAG 환자에서 더 큰 영향을 미쳐 다양성을 감소시키는 현상은, 위암이 남성에서 더 흔한 이유 중 하나로 작용할 가능성도 있습니다.
또한 본 연구에서는 AAG 환자의 위 마이크로바이오타를 속(genus) 수준에서 분석한 결과, Gemella, Haemophilus, Neisseria가 여성에서 남성보다 유의하게 더 자주 발견되었습니다. 위산 결핍 상태에서의 인간 위 마이크로바이오타에 관한 기존 연구에서도 Streptococcus 다음으로 Gemella와 Haemophilus가 AAG 환자에서 가장 우세한 속으로 보고되었으며 [15], 이는 또 다른 연구에서도 확인되었습니다 [13]. 다만 기존 연구들에서는 성별에 따른 분석이 이루어지지 않았습니다. AAG는 다른 자가면역 질환과 마찬가지로 여성에서 더 흔한데, 여성 AAG 환자에서 이들 세균이 더 많이 존재하는 것은 이들이 AAG 발병에 병인적 역할을 할 가능성을 시사합니다.
본 연구의 주요 제한점으로는, 비교적 소규모의 표본 수와 연구 대상자의 식이 및 흡연 습관에 대한 자료 부족이 있습니다. 또한 위내시경은 몇 시간의 금식과 탈수를 포함하는 비정상적인 상태에서 시행되므로, 위 마이크로바이오타의 실제 동적 상태를 반영하지 못할 수 있습니다. 마지막으로, 본 연구에서 사용한 DNA 시퀀싱 방법은 살아있는 세균과 죽은 세균, 정착균과 일시균을 구분하지 못하는 한계가 있습니다.
5. Conclusions
In conclusion, the current study shows that the gender differences in gastric microbiota, particularly a higher gastric bacterial abundance and less microbial diversity in healthy women compared to men, seem to be reset in autoimmune atrophic gastritis, likely due to hypochlorhydria and the non-acid intragastric environment, reducing biodiversity to greater extent in men. The impact of these findings on gastric physiology and the gender specific natural history of autoimmune atrophic gastritis remains to be elucidated; in any case, gender differences deserve attention in gastric microbiota studies.
다음 연구에서는 이러한 성별의 차이를 고려하여, 질환에 대한 잠재적 차이에 대한 microbiota의 효과적인 역할 및 질환에 대해 성별이 미치는 영향을 고려하여 진행될 수 있을 것 같습니다.
Abstract: Gender differences and microbiota are gaining increasing attention. This study aimed to assess gender differences in gastric bacterial microbiota between subjects with healthy stomachs and those with autoimmune atrophic gastritis. This was a post hoc analysis of 52 subjects undergoing gastroscopy for dyspepsia (57.7% healthy stomach, 42.3% autoimmune atrophic gastritis). Gastric biopsies were obtained for histopathology and genomic DNA extraction. Gastric microbiota were assessed by sequencing the hypervariable regions of the 16SrRNA gene. The bacterial profile at the phylum level was reported as being in relative abundance expressed as 16SrRNA OTUs (>0.5%) and biodiversity calculated as Shannon-diversity index-H. All data were stratified for the female and male gender. Results showed that women with healthy stomachs had a higher gastric bacterial abundance and less microbial diversity compared to men. Likely due to hypochlorhydria and the non-acid intragastric environment, autoimmune atrophic gastritis seems to reset gender differences in gastric bacterial abundance and reduce biodiversity in males, showing a greater extent of dysbiosis in terms of reduced biodiversity in men. Differences between gender on taxa frequency at the phylum and genus level in healthy subjects and autoimmune atrophic gastritis were observed. The impact of these findings on the gender-specific natural history of autoimmune atrophic gastritis remains to be elucidated; in any case, gender differences should deserve attention in gastric microbiota studies.